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新技術來提高基因組單堿基定點突變的效率齊一生物
點擊次數：237 發布時間：2017/2/28 13:57:38
單核苷酸點突變是作物許多重要農藝性狀發生變異的遺傳基礎。單堿基的變異會導致氨基酸替換或蛋白質翻譯終止, 使基因功能發生改變，從而有可能產生優良的等位基因與優異性狀。傳統誘變及單堿基突變篩選技術（如 TILLING）需要進行基因組規模的篩選，耗時、耗力且鑒定到的點突變數目和種類有限�；蚪M編輯技術，特別是基于 CRISPR/Cas9 系統的基因組編輯技術，可以在基因組靶向位點處產生 DNA 雙鏈斷裂（DSB），以人為提供的外源供體 DNA 為模板，通過同源重組（HR）介導的 DNA 修復途徑來實現對目標基因的單堿基突變。然而，植物中同源重組效率目前非常低，很難以此實現高效的、穩定的單堿基突變。因此，植物育種和基因功能研究迫切需要新技術來提高基因組單堿基定點突變的效率，以實現基因功能與農藝性狀的定向改良。
中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組致力于作物基因組編輯方法的研究和應用。在前期工作基礎上，借鑒哺乳動物單堿基編輯方法，高彩霞研究組利用 Cas9 變體（nCas9-D10A）融合大鼠胞嘧啶脫氨酶（rAPOBEC1）和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI），構成了高效的植物單堿基編輯系統 nCas9-PBE，成功地在三大重要農作物（小麥、水稻和玉米）基因組中實現高效、精確的單堿基定點突變。通過在原生質體中對報告基因 BFP 以及三種作物中五個內源基因七個位點突變結果的詳細分析, 發現 nCas9-PBE 可實現對靶位點 DNA 的 C 至 T 替換，C 堿基脫氨化的窗口覆蓋靶序列的 7 個核苷酸（距離 PAM 遠端的第 3- 9 位）；其中單個 C 的替換效率為 0.39-7.07%，多個 C 的替換效率高達 12.48%。通過遺傳轉化，利用該體系獲得了靶標區域單堿基替換的小麥、水稻和玉米突變植株，突變效率可達 43.48%。nCas9-PBE 技術無需在基因組的靶位點產生 DNA 雙鏈斷裂（DSB），也無需供體 DNA 的參與，具有簡單、廣適、高效的特點。nCas9-PBE 單堿基編輯系統成功建立和應用，為高效和大規模創制單堿基突變體提供了一個可靠方案，為作物遺傳改良和新品種培育提供了重要技術支撐。
該研究成果于 2016 年 10 月 31 日投稿，經嚴格的同行評議，2017 年 2 月 5 日被正式接受，2017 年 2 月 27 日在線發表于 Nature Biotechnology 雜志 (doi:10.1038/nbt.3811)。高彩霞研究組的博士生宗媛和王延鵬為該論文的共同作者。該研究得到科技部，農業部，中科院以及國家自然基金委的資助。
原創作者：齊一生物科技（上海）有限公司
