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線粒體復合體Ⅰ試劑盒說明書
點擊次數：292 發布時間：2016/9/23 8:54:48
線粒體復合體Ⅰ試劑盒說明書
分光光度法 25 管/24 樣
正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義
復合體Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又稱 NADH-CoQ 還原酶或 NADH 脫氫酶，廣泛存在于動物、植物、
微生物和培養細胞的線粒體中，是線粒體內膜中的蛋白復合物。該酶催化一對電子從
NADH 傳遞給CoQ，同時可使O2還原生成 O2.-
，是呼吸電子傳遞鏈上產生O2.-
的主要部位。
測定該酶活性，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈（ETC）狀態，而且可以反映活性氧（ROS）
生成狀態。
線粒體復合體Ⅰ試劑盒說明書 測定原理
復合體Ⅰ能夠催化NADH 脫氫生成 NAD+
， 在 340nm下測定 NADH 的氧化速率計算出該酶
活性的大小。
需自備的儀器和用品
紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸
餾水。
試劑的組成和配制
試劑一：25mL×1瓶，-20℃保存；
試劑二：5mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：0.5 mL×1瓶，-20℃保存；
試劑四：25mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑五：1 mL×1 支，-20℃保存；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存，用時加入2mL蒸餾水，現配現用；
工作液的配制：臨用前將試劑五轉移到試劑四中混合溶解；現配現用；
樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
① 準確稱取 0.1g組織或收集 500萬細菌或細胞，加入1mL試劑一和 10uL 試劑三，用冰
浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿 600g，4℃離心5min。
③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅰ（此步可選
做） 。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入 200uL試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，
功率 20％或200W，超聲 3s，間隔 10秒，重復30 次），用于復合體Ⅰ酶活性測定。
測定步驟：
1、 分光光度計預熱 30min以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。
2、 樣本測定
（1）工作液于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）孵育 5min。
（2）在 1mL石英比色皿中加入 40μL樣本、800μL工作液和 60μL試劑六，立即混勻，
記錄 340nm處初始吸光值 A1和 2min后的吸光值 A2，計算 ΔA=A1-A2。
復合體Ⅰ活力單位的計算
（1）按蛋白濃度計算
單位的定義：每 mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅰ活力 （nmol/min/mg prot） =[ΔA×V反總÷ （ε×d） ×109
]÷(V樣×Cpr) ÷T=1808×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每 g組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109
]÷(W× V 樣÷V 樣總)
÷T=365×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
線粒體復合體Ⅰ試劑盒說明書 單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅰ活力(nmol/min/104
cell)=[ΔA×V反總÷ （ε×d） ×109
]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.73×ΔA
V反總：反應體系總體積，9×10-4
L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×103
L / mol /cm；d：
比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.04 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；
T：反應時間，2 min；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬。
原創作者：齊一生物科技（上海）有限公司
