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基于體外細胞培養和模型的化妝品抗衰老功效評價
點擊次數：245 發布時間：2021/1/5 10:09:30
本文要點：角質形成細胞、成纖維細胞及相關模型與抗衰老功效評價
01
皮膚衰老的特征指標
衰老細胞發生的變化：細胞形態變大，扁平;衰老相關的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal) 活性增強;p16上調;lamin B1表達減少;HMGB1核移位至細胞質和細胞外液;衰老相關分泌表型(SASP)的分泌，包括炎癥細胞因子和金屬蛋白酶......
SASP由促炎細胞因子、生長因子、趨化因子和基質重塑酶等一系列細胞因子組成，它們可以導致機體慢性低度炎癥和疾病，并可以反作用于衰老細胞及其鄰近細胞加速它們的衰老進程，并可作為新的細胞衰老效應機制。
圖1 年輕和衰老皮膚示意圖
(Biomarkers of Cellular Senescence ａnd Skin Aging,2018)
圖2 與皮膚衰老相關的生物指標
(Biomarkers of Cellular Senescence ａnd Skin Aging,2018)
02
基于人皮膚角質形成細胞的抗衰老功效評估
人表皮中的主體細胞成分是角質形成細胞，此類細胞經過增殖和分化 ，*終形成包括基底層 、棘層 、粒層 及角質層的表皮復層結構 。人角質形成細胞是表皮中重要的細胞，也是紫外線敏感的靶細胞。近年來研究表明，人角質形成細胞在光老化的發生和發展中起重要作用，在加重炎癥反應方面也尤為突出。
圖3 炎癥因子含量隨著紫外照射劑量的增加而增加
紫外線可活化Rel家族中的核因子κB，導致細胞因子、黏附分子以及一氧化氮合成酶和環氧化酶等炎癥性酶類合成。促炎性細胞因子包括白細胞介素（IL）1β、IL⁃6、IL⁃8和腫瘤壞死因子TNF-α等。上述細胞因子又可通過促進活化蛋白1和核因子κB途徑，放大皮膚對UV照射的反應。
人皮膚永生化角質細胞 HaCaT是非腫瘤來源的人正常皮膚角質形成永生化細胞株，較易于培養及傳代。目前 HaCaT細胞株已被廣泛應用于化妝品的抗衰老及透皮性的研究中。
在 Zöller 等的一項體外研究中，比較了培養基中添加溫泉水（理膚泉、雅漾）和飲用天然礦泉水（heppinger、adelholzener）對人角質形成細胞生理參數的影響。結果表明，溫泉水被 UV 刺激后產生活性氧，用酶聯免疫吸附試驗和啟動子的轉錄測定，發現可反轉IL⁃6的誘導；天然礦泉水也能對上述炎性因子產生影響，但程度較輕。
03
成纖維細胞的抗衰老功效評估
人皮膚成纖維細胞(Human skin fibroblasts, HSF)是人體皮膚真皮中的主體細胞，具有合成和分泌膠原纖維、彈性纖維及其他機質成分的功能，這些成分和成纖維細胞共同維持真皮層的彈性。
圖4 成纖維細胞在自然老化和光老化中的區別
研究人員證實，自然老化皮膚的膠原降低是由于成纖維細胞合成膠原減少，分泌的基質金屬蛋白酶(MMP-1，MMP-2)增加，而光老化皮膚的膠原減少主要是成纖維細胞分泌基質金屬蛋白酶增加，膠原合成下降不明顯。由此可見成纖維細胞的膠原代謝在自然老化和光老化之間有一定差別。
1 體外增殖能力檢測
成纖維細胞除了分泌膠原纖維、彈性纖維維持皮膚彈性之外，還有趨化性和粘附性 ，對維持皮膚的彈性和韌性具有重要作用，HSF的數量減少是引起皺紋產生的重要原因。
真皮中成纖維細胞的數量及活力均會影響膠原蛋白的分泌、膠原蛋白纖維的數量以及膠原蛋白纖維束構造。成纖維細胞生長因子是其增殖*有效的刺激因子，可以作為實驗的陽性對照，評價化妝品是否有效刺激成纖維細胞增殖。
圖5 基于成纖維細胞的樣品增殖效果測試
2 膠原含量檢測
膠原蛋白是細胞外基質中*活躍的成分，是創面愈合和瘢痕形成的關鍵因素，在皮膚功能修復中起重要作用。正常成人皮膚中HSF分泌的膠原主要以Ⅰ和Ⅲ 型為主。其中Ⅰ型膠原是構成正常成人皮膚的主體， 而正常胎兒皮膚主要由Ⅲ型膠原組成。
膠原含量的測定有多種方法，通過ELISA 法和western Blot和免疫熒光等方法可分別精確定量體外培養的HSF分泌及細胞本身膠原含量的變化。
圖6 基于成纖維細胞的膠原蛋白定量檢測（免疫熒光法；來自博溪生物）
3 抗氧化功效檢測
正常人體細胞每天生化代謝產生大量的ROS。細胞中過氧化物酶發揮了清除ROS的功能，起抗氧化作用。其中超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）在自由基生成的起始階段發揮預防性作用，而谷胱甘肽過氧化物酶（GSH- Px）發揮抗脂質過氧化作用。
通過流式細胞術直接檢測 HSF內ROS水平的改變、通過比色法檢測SOD，CAT 和GSH-Px等酶活性的變化，均能靈敏反映出化妝品抗氧化功效。
4 其他衰老相關生物指標檢測
衰老細胞通常體積變大，溶酶體衰老相關的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）酶活性增高。采用免疫組化法觀察β-半乳糖苷酶染色細胞的顏色變化以及用比色法定量β-半乳糖苷酶活性，可以評估HSF衰老程度的變化。
丙二醛（MDA）是脂質過氧化重要產物，在衰老過程中顯著累積，與皮膚老年斑（褐脂質）含量呈正相關。目前ＭＤA被認為是一種重要的衰老生物標記物，通過ELISA法檢測MDA含量變化是比較靈敏的HSF老化評價方法。
5 案例展示
Wang等發現紫外線輻照后成纖維細胞中 SA-β-gal 活性增強，作為衰老的生物標志物，表明 UVB 照射誘導細胞進入衰老狀態;同時觀察到染料木素能有效地抑制 SA-β-gal 的表達，且呈劑量依賴性（SA-β-gal 染色陽性細胞為藍色）。
Wang Y N , Wu W , Chen H C , et al. Genistein protects against UVB-induced senescence-like characteristics in human dermal fibroblast by p66Shc down-regulation[J]. Journal of Dermatological ence, 2010, 58(1):19-27.
圖7 UVB 照射誘導 HDFs 中 SA-β-gal 表達及染料木黃酮的保護作用
接下來，用不同濃度的染料木黃酮處理細胞24小時，ELISA檢測 HDFs 細胞內 SOD 和 MDA 水平。實驗發現即使在沒有 UVB 照射的情況下，染料木黃酮處理仍能誘導 HDFs 中 SOD 活性并抑制細胞內 MDA 水平。
UVB 輻照導致細胞內 SOD 活性顯著降低，同時細胞內 MDA 水平升高，說明 HDFs 對 UVB 的氧化應激反應增加。而加入不同濃度的染料木黃酮后，引起細胞內 SOD 活性的增加，在高劑量時 MDA 水平顯著降低。
圖8 不同濃度的染料木黃酮對成纖維細胞內SOD和MDA水平的影響
04
三維皮膚模型抗衰老功效評價
隨著三維細胞培養技術的發展，三維人造皮膚模型可以在體外培養中模擬人體皮膚構造以及皮膚不同細胞間、細胞與細胞基質間的各種反應，使它更有效地應用于化妝品工業，對于快速篩選新型功效性原料具有實際意義。
在三維皮膚模型上評價抗皺劑等的功效性與單層細胞培養相比，更接近于生物體的真實狀態，可以用于毒性分析和功效測試，是保證化妝品安全功效的重要手段。
實驗時將活性物質配制成膏霜等劑型，涂于重建皮膚模型上，通過測試相關指標，如清除自由基能力、 抗氧化能力和膠原蛋白含量，可以考察化妝品對細胞增殖分化及抗氧化能力的影響。
圖9 3D皮膚模型的給藥方式（來自博溪生物）
基于三維皮膚模型的抗衰老功效評價體系，可以分為抗表皮衰老和抗真皮衰老。兩者可以通過構建不同的模型來實現更好的生物學指標響應。
比如表皮模型是由角質形成細胞構建形成，如下圖所示。構建完成后，通過低劑量的UV照射連續照射進行干預，隨后對組織形態、屏障相關指數等指標進行檢測。
圖10 體外重組表皮模型的工藝流程及評測指標
此外還可以通過構建全層皮膚模型進行真皮抗衰的評價。它的特點在于有真表皮結構，可以在體外進行細胞外基質含量變化的檢測，從而進行抗衰老原料特別是化妝品成品的篩選。詳情可點擊鏈接《它為什么可以評估化妝品抗光損傷的效果？》
05
離體皮膚
離體皮膚的特點在于它天然而復雜組織構成：包括了天然表皮層和真皮層，真皮層中的纖維包括膠原纖維（95%）、彈力纖維和網狀纖維等，這樣的天然構成，使一體化地觀測受試樣品對皮膚的綜合或者特定影響成為可能。
但是，離體皮膚難獲取、難培養也使很多研究者望而卻步。
目前博溪生物已經攻克了離體皮膚培養的問題，并應用離體皮膚來進行化妝品的功效評價。首先要解決的核心問題是“長程培養”的問題。目標是要讓離體皮膚單元保持正常的生理活性，以滿足各類檢測、樣品長時間暴露的需求，同時關注增殖與分化指標的平衡問題。
1 離體皮膚的培養
1）首先從臨床取得捐獻的離體皮膚組織，用皮膚取樣器分割成一定大小的單元，用于后續研究；
2）對離體皮膚單元進行氣液面培養，這是*為關鍵的步驟；在博溪生物的體系中，采用了自主開發的培養基來進行，這也得益于一直專注于皮膚模型開發的培養基技術的積累。
3）培養完成之后，收集離體皮膚單元，進行具體指標的檢測。
圖11 離體皮膚的培養流程
2 基于Exvivo的抗衰老評價體系
在光輻照的誘導下，皮膚細胞經歷高水平、長期的氧化應激損傷；氧化應激和慢性炎癥又進一步介導細胞外基質（ECM）的水平降低和細胞功能的老化；因此，我們在抗衰護膚品設計與評價中，可以從拮抗氧化應激、增加ECM合成、降低ECM降解、以及修復衰老細胞等角度入手。
圖11 基于離體皮膚(ex vivo skin)的抗衰評價指標
3 案例展示：樣品對離體皮膚(ex vivo skin)彈性纖維的影響
圖12 免疫組化法檢測樣品對離體皮膚彈性纖維的影響（博溪生物）
結論：從IHC染色結果看，對照組真皮層內可見長束狀彈性纖維，排列均勻、有序，UVR 照射處理后彈性纖維減少，排列稀疏、 多呈斷層式分布。陽性物質使用后，彈性纖維密度明顯提升。
上述方法，匯總和梳理了基于體外細胞培養和模型建立的抗衰老功效評價方法，旨在針對不同的功效和評價需求,體外培養特定細胞或建立細胞損傷模型,使用目標成分刺激，觀察細胞形態和毒性增殖等指標,通過分析特定基因通路、相關蛋白表達等分子生物學手段對原料或者成品進行功效評價。
由于體外細胞實驗具有經濟成本較低、實驗周期較短、實驗對象相對穩定且操作方法成熟等特點,應用細胞生物學方法建立體外培養皮膚細胞模型成為化妝品原料篩選和活性物質功效評價的主流方法。
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參考文獻
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