生鮮牛乳中三聚氰胺的測定

1 范圍

本標準規定了生鮮牛乳中三聚氰胺的制樣和檢測方法，包括高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜質譜法（GC-MS），其中氣相色譜質譜法為仲裁法。

本標準適用于生鮮牛乳中三聚氰胺的測定。

本標準中高效液相色譜法檢出限為0.1 mg/kg，氣相色譜質譜法檢出限為0.05 mg/kg。

2 規范性引用文件

下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的*新版本。凡是不注日期的引用文件，其*新版本適用于本標準。

GB/T 6682 分析實驗室用水規格和試驗方法

3 高效液相色譜法

3.1 方法提要

試樣中的三聚氰胺用1％三氯乙酸提取，離心后取部分提取液，用陽離子交換柱凈化，氨化甲醇洗脫，洗脫液經氮氣吹干用甲醇溶液溶解，用配備紫外檢測器或二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀進行定量測定。

3.2 試劑與材料

除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合 GB/T 6682 二級水的規定。

3.2.1 乙睛：色譜純。

3.2.2 庚烷磺酸鈉。

3.2.3 檸檬酸。

3.2.4 乙酸鉛。

3.2.5 甲醇：色譜純。

3.2.6 氨水：濃度25%－28%。

3.2.7 SPE柱：陽離子交換柱，60 mg／3 mL。

3.2.8 1％三氯乙酸：稱取10g三氯乙酸溶解于1000 mL水中，混勻。

3.2.9 5％氨化甲醇：量取5mL氨水（3.2.6），溶解于100 mL甲醇（3.2.5）中，混勻。

3.2.10 乙酸鉛溶液（22 g/L）：稱取22 g乙酸鉛（3.2.4），加水適量溶解后定容至1000 mL。

3.2.11 甲醇溶液：取甲醇（3.2.5）200 mL加水800 mL，混勻。

3.2.12 濾膜：0.45 μm。

3.2.13 流動相：稱取2.02 g庚烷磺酸鈉（3.2.2）和2.10 g檸檬酸（3.2.3）加水溶解后稀釋至1000 mL，取該溶液900 mL加入100 mL乙腈，混勻。

3.2.14 三聚氰胺對照品（≥99.0％）。

3.2.15 三聚氰胺標準貯備液（1 mg/mL）：稱取100 mg（精確到0.1 mg）三聚氰胺對照品，用甲醇溶液（3.2.11）溶解并稀釋至100 mL量瓶中，貯存于0℃～8℃冰箱中，有效期1個月。

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3.2.15.1 三聚氰胺標準工作液：取三聚氰胺標準貯備液（3.2.15）適量，分別用甲醇溶液（3.2.11）稀釋為0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、50 μg/mL的標準工作液，貯存于0℃～8℃冰箱中，有效期7天。

3.3 儀器與設備

3.3.1 高效液相色譜儀，配備紫外檢測器或二極管陣列檢測器。

3.3.2 高速冷凍離心機。

3.3.3 渦旋混合器。

3.3.4 cm-12水浴氮吹儀。

3.3.5 MEDIWAX固相萃取裝置。

3.3.6 THZ-82A振蕩搖床。

3.4 測定步驟

3.4.1 提取

稱取5.0 g樣品，準確加入19 mL 1％的三氯乙酸（3.2.8）溶液，加入1 mL乙酸鉛溶液（3.2.10）。振蕩提取20 min，在10000 r/min離心機上離心5 min。

3.4.2 凈化

分別用3 mL甲醇，3 mL水活化SPE柱，準確移取10 mL離心上清液分次上柱，再用3 mL水和3 mL甲醇洗滌SPE柱，抽干，用3 mL 5％氨化甲醇溶液（3.2.9）洗脫，收集洗脫液，抽干，洗脫液于氮吹儀上50℃氮吹至干，加1 mL甲醇溶液（3.2.11），振蕩溶解，搖勻，過0.45 μm濾膜，上機測定。

3.4.3 測定

3.4.3.1 液相色譜條件

色譜柱：C8柱，150×4.6 mm（i.d），5 μm，或性能相當者；

流速：1 mL／min；

柱溫：室溫；

檢測波長：235 nm；

進樣量：20 μL。

3.4.3.2 定量測定方法

樣品溶液與標準溶液保留時間的相對偏差應不大于2％，外標法定量，待測樣液中三聚氰胺的響應值應在工作曲線范圍內。

3.5 結果計算和表述

按照下式計算試樣中三聚氰胺的含量： nmAsVCsAX××××=……………………………………………………………………………………（1）

式中：

X－試樣中三聚氰胺的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

A－試樣溶液對應的色譜峰面積響應值；

As－標準溶液對應的色譜峰面積響應值；

V－凈化后加入的甲醇溶液體積，單位為毫升（mL）；

Cs－三聚氰胺標準溶液的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

m－試樣質量，單位為克（g）；

n — 提取稀釋倍數。

平行測定結果用算術平均值表示，結果保留三位有效數字。

3.6 檢測方法靈敏度、準確度、精密度

3.6.1 靈敏度

本方法生鮮牛乳中三聚氰胺的檢出限為0.1 mg/kg。

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3.6.2 準確度

本方法在0.1 mg/kg～25.0 mg/kg添加濃度的回收率為80％～120％。

3.6.3 精密度

本方法的批內變異系數CV≤10％，批間變異系數CV≤15％。

4 氣相色譜質譜法（仲裁法）

4.1 方法提要

試樣中的三聚氰胺用1％三氯乙酸提取，經陽離子交換柱凈化，用BSTFA+1%TMCS衍生化，用氣相色譜質譜儀進行定性和定量分析。

4.2 試劑與材料

4.2.1 衍生化試劑：N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）+1%三甲基氯硅烷（TMCS）；

4.2.2 吡啶：色譜純；

4.2.3 其他試劑和材料同3.2.5－3.2.12；

4.2.4 三聚氰胺標準工作液：取三聚氰胺標準工作液（3.2.16），用甲醇溶液（3.2.11）稀釋為0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL的標準工作液。

4.3 儀器與設備

4.3.1 氣相色譜質譜儀；

4.3.2 恒溫干燥箱；

4.3.3 其它儀器同3.3.2—3.3.6。

4.4 測定步驟

按3.4.1和3.4.2進行提取與凈化。

4.4.1 衍生化

取3.4.2的凈化液，用甲醇溶液（3.2.11）稀釋到標準工作液線性范圍內的濃度，取400 μL置于帶蓋玻璃試管中，氮氣吹干，加入200 μL的吡啶（4.2.2）和200 μL的BSTFA+1%TMCS（4.2.1），混勻，在70℃衍生30 min，放冷后上機測定。同時分別取三聚氰胺標準工作液（4.2.4）400 μL，氮氣吹干，做同步衍生。

4.4.2 測定

4.4.2.1 氣相色譜質譜條件

色譜柱：

HP-5MS，5％苯基甲基聚硅氧烷彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），或性能相當者；

載氣：氦氣（He），純度≥99.999％；

流速: 1.3 mL/min；

進樣：不分流進樣，進樣體積為1 μL，進樣口溫度: 250ºC；

升溫程序：起始溫度為75ºC，持續1.0 min，以30ºC/min升溫至300ºC，保持2.0 min；

傳輸線溫度：280ºC；

掃描模式：選擇離子掃描；

監測離子：99、171、327、342 m/z；

溶劑延遲: 4 min；

四極桿溫度: 150ºC；

離子源溫度: 230ºC ；

EI源轟擊能：70 eV。

4.4.2.2 定性定量方法

定性方法：樣品與標準衍生溶液保留時間的相對標準偏差不大于0.5%，特征離子基峰豐度與標準衍生溶液相差不大于20％。

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定量方法：以342，327，171，和99峰面積之和進行校正定量。

4.5 結果計算和表述

按照下式計算試樣中三聚氰胺的含量： 21nnmAsVCsAX×××××=……………………………………………………………………………（2）

式中：

X－試樣中三聚氰胺的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

A－試樣溶液對應的色譜峰面積響應值；

As－標準溶液對應的色譜峰面積響應值；

V－凈化后加入的甲醇溶液體積，單位為毫升（mL）；

Cs－三聚氰胺標準溶液的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

m －試樣質量，單位為克（g）；

n1 — 提取稀釋倍數；

n2 — 衍生前稀釋倍數。

平行測定結果用算術平均值表示，結果保留三位有效數字。

4.6 檢測方法靈敏度、準確度、精密度

4.6.1 靈敏度

本方法生鮮牛乳中三聚氰胺的檢出限為0.05 mg/kg。

4.6.2 準確度

本方法在0.05 mg/kg～2.0 mg/kg添加濃度的回收率為80％～120％。

4.6.3 精密度

本方法的批內變異系數CV≤10％，批間變異系數CV≤15％。

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附 錄 A 液相色譜圖及光譜圖

A.1 三聚氰胺標準溶液色譜圖

圖 A.1：三聚氰胺標準溶液色譜圖

A.2 樣品中添加三聚氰胺色譜圖

圖 A.2：樣品中添加三聚氰胺色譜圖

A.3 三聚氰胺紫外光譜圖

圖 A.3：三聚氰胺紫外光譜

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附 錄 B 氣相色譜圖及離子質譜圖

B.1 三聚氰胺標準溶液衍生物選擇離子色譜圖

圖 B.1 三聚氰胺標準溶液衍生物選擇離子色譜圖

B.2 三聚氰胺標準溶液衍生物選擇離子質譜圖

圖 B.2 三聚氰胺標準溶液衍生物選擇離子質譜圖

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