ELISA試劑盒預實驗設置

一、實驗目的

ELISA試劑盒預實驗是為了確保實驗的準確性和可靠性,驗證試劑盒的靈敏度和特異性,同時為正式實驗提供參考。通過預實驗,可以了解實驗條件、操作流程和注意事項,為后續的實驗提供指導和幫助。

二、實驗原理

ELISA試劑盒是一種基于酶聯吸附法的檢測方法,通過將特異性抗體或抗原與酶結合,形成酶標抗體或抗原。當待測樣本與酶標抗體或抗原發生特異性結合時,酶會催化底物生成有色產物,通過顏色變化來檢測待測樣本中的抗原或抗體。預實驗則是通過調整實驗條件,如溫度、時間、濃度等,來驗證試劑盒的 反應條件。

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三、實驗步驟

1. 準備試劑和樣本

按照試劑盒說明書準備所需的試劑和樣本。確保試劑的質量和有效性,同時對樣本進行適當的處理和稀釋。

2. 設置實驗條件

根據預實驗的目的,設置不同的實驗條件,如溫度、時間、濃度等。一般而言,可以通過設置不同的溫度、時間和濃度梯度來尋找 反應條件。

3. 實驗操作

按照試劑盒說明書進行實驗操作。在每個實驗條件下,分別進行多次重復實驗,以減少誤差和提高實驗的準確性。

4. 結果觀察和記錄

觀察實驗結果,記錄每個條件下的吸光度值或顏色變化情況。通過比較不同條件下的結果,可以確定 反應條件。

四、實驗結果分析

1. 確定 反應條件

通過對不同條件下的實驗結果進行分析,可以確定 反應條件。這些條件包括溫度、時間、濃度等。在 反應條件下,酶標抗體或抗原與待測樣本中的抗原或抗體能夠充分結合,生成的顏色變化 ,從而得到準確的檢測結果。

2. 驗證試劑盒的靈敏度和特異性

通過預實驗,可以驗證試劑盒的靈敏度和特異性。靈敏度是指試劑盒能夠檢測到的小抗原或抗體濃度;特異性則是指試劑盒只與特定的抗原或抗體結合,不與其他物質發生交叉反應。在預實驗中,可以通過比較不同濃度的標準品或已知樣本的檢測結果,來評估試劑盒的靈敏度和特異性。

五、注意事項

1. 嚴格遵守實驗操作規程,避免污染和交叉反應。
2. 在使用試劑盒時,要注意試劑的有效期和質量,避免使用過期或質量不佳的試劑。
3. 在實驗過程中,要注意觀察實驗現象,及時記錄和整理實驗數據。
4. 在分析實驗結果時,要結合試劑盒說明書和相關文獻資料,進行科學合理的解釋和評估。

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效果測定
測定內容包括酶和抗體活性、結合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結合率。
⑴ 酶與抗體的活性 常用瓊脂擴散或電泳法,使抗原與抗體形成沉淀線,經PBS漂洗1天,再以蒸餾水浸泡1小時,將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色,如果出現應有的顏色反應,再用生理鹽水浸泡,顏色仍然不褪,表示結合物既有酶的活性,也有抗體活性。良好的結合物在顯色后,瓊擴滴度應在1:16以上。另一個測定方法是用系列稀釋的酶標抗體直接以ELISA方法進行方陣滴定,此法不僅可以測定標記效果,還可以確定酶標抗體的使用濃度。
⑵ 結合物的定量測定 一般是對結合物中的酶和IgG進行定量測定。常用紫外分光光度計于403nm和280nm進行測定,然后按下列公式計算:
酶量(mg/ml)=OD403×0.42
IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.4)×0.94×0.62
對于過碘酸鈉氧化法制備的標記抗體量,按下列公式計算:
IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.34)×0.62
已知酶量和IgG量后,即可計算出標記抗體的摩爾(mol)比值。
HRP/IgG摩爾比值=HRP(mg/ml)/IgG(mg/ml)×4
結合物中酶總量=HRP(mg/ml)×結合物溶液量
結合物產率=結合物中酶總量/標記時加入的酶量×
用于ELISA的結合物的酶量為400(g/ml時效果一般,為500(g/ml時效果較好,達 1000(g/ml時效果 。mol.比值由于結合物中含的IgG并不完全可靠,所以不能作為主要參數。一般認為mol.比值為0.7時效果一般,1.0時效果較好,1.5-2.0時 。酶結合率為 7%時效果一般,為9%-10%較好,達30%以上時 。
ELISA方法的基本類型、用途及操作程序
根據ELISA所用的固相載體而區分為三大類型:一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA,即我們通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA,稱為斑點ELISA(Dot-ELISA);再一類是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA,稱為布ELISA(C-ELISA)。在微量板ELISA中,又根據其性質不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。
間接ELISA
本法主要用于檢測抗體。以鴨(DVH)抗體的ELISA為例,間接ELISA的操作程序如下。
⑴ 材料
① 包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液;
② DVH包被抗原、酶標抗抗體、陰性及陽性DVH參考血清;待檢鴨血清;
③ ELISA檢測儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。
⑵ 方法步驟
① 加抗原包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時,洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗體 → 37℃ 2小時,洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 30分鐘,加終止液
⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值,并計算出P/N比值。
⑶ 結果判定 已知陽性血清與已知陰性血清的比值(P/N)≥2.1,而且已知陽性血清的OD值≥0.4;在上述條件成立的情況下,如果待檢血清與已知陰性血清的比值(P/N)≥2.1,而且待檢血清的OD值≥0.4,則判為陽性,否則判為陰性。
雙抗體夾心
本法主要用于檢測大分子抗原�，F以檢測雞病毒(IBDV)的雙夾心抗體ELISA為例介紹本法的操作程序。
① 加抗體包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原 → 37℃ 30分鐘,洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗體 → 37℃ 30分鐘,洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 15分鐘,加終止液
⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值。
雙夾心ELISA
此法與雙抗體夾心ELISA的主要區別在于:它是采用酶標抗抗體檢查多種大分子抗原,它不僅不必標記每一種抗體,還可提高試驗的敏感性。此法的基本程序為:
① 加抗體(Ab-1)包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原(Ag) → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
③ 加用非同種動物生產的特異性抗體(Ab-2)→ 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
④ 加入酶標抗Ab-2抗體(AB-3)→ 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液
⑥ 用ELISA檢測儀測定OD值。
競爭ELISA
此法主要用于測定小分子抗原及半抗原,其原理類似于放射測定。其基本程序為:
① 抗體包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 加入待檢抗原及一定量的酶標抗原(對照孔僅加酶標抗原)→ 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
③ 加底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液
④ 用ELISA檢測儀測定OD值。
被結合的酶標抗原的量由酶催化底物反應產生有色產物的量來確定,如果待檢溶液中抗原越多,被結合的標記抗原的量就越少,有色產物就減少,這樣根據有色產物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優點在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測;其主要不足在于每種抗原都要進行酶標記,而且因為抗原的結構不同,還需應用不同的結合方法。此外,試驗中應用酶標抗原的量較多。