關鍵詞： 多種染色方法 總結 來源：丁香園論壇

A

篤瑪生物關注AgNOR 染色法：

1、試劑配制：

（1）AgNOR 染色液：

甲液：明膠 2 g 溶于雙蒸水至 99 ml，在 60℃ 使之完全溶解，再加入純甲酸 1 ml 搖勻待用。

乙液：硝酸銀 50 g 溶解于雙蒸水中至 100 ml，4℃ 冰箱保存。

（2）AgNOR 工作液

取甲液 10 ml，乙液 20 ml 臨用前混合。

2、步驟：

（1）切片脫蠟至水

（2）雙蒸水洗 2 次

（3）AgNOR 工作液中（25℃）浸染 30 分鐘（暗處進行）（鏡下觀察）

（4）雙蒸水洗 3 次

（5）脫水, 透明, 封固

3、結果：油鏡觀察，細胞核及胞質背景為淡黃色， AgNOR 呈棕黑色顆粒狀。

B

篤瑪生物說明鞭毛染色法:

１．試劑配制：

甲液：丹寧酸 ５克，氯化鐵（FeCl₃）１．５克，福爾馬林（15％）２．０毫升，氫氧化鈉（ＮａＯＨ）１％ １．０毫升

乙液：硝酸銀（ＡｇＮＯ₃）２克

蒸餾水 100 毫升

制備乙液時，待硝酸銀溶解后，取出１０毫升備用，向余下的９０毫升硝酸銀液中滴加濃氫氧化銨，先呈很濃厚的沉淀，再繼續滴加至剛剛溶解沉淀成澄清液為止。再將備用的硝酸銀溶液慢慢逐滴加入澄清液中，先呈現薄霧，但輕搖則消失，繼續邊滴加邊搖動，待澄清液呈現略有輕微不消散的薄霧狀為止。如霧重，則銀鹽沉淀，不宜使用。

２．染色方法：

（１）將待檢菌接種在新制備的肉湯瓊脂斜面上，置３７°培養１６—２０小時，備用。

（２）在載玻片的中部相隔一厘米處，用接種環各沾一滴蒸餾水，然后用接種環挑取濕潤處的菌苔少許于一端的水滴中，傾斜玻片使培養物流至另一水滴中，兩水滴自然相通，菌體從上位自然擴散到下位水滴中，待干燥后染色。

（３）在干燥涂片上加甲液３—５分鐘，用蒸餾水沖洗。將殘水瀝干或用乙液沖去殘水后，加適量乙液保持３０—６０秒鐘。染色時在酒精燈上稍加熱，使染液出現蒸汽即可，用蒸餾水沖洗。

（４）鏡檢：菌體及鞭毛皆染成茶色。

３．注意事項：

（１）染液隨用隨配，存放至次日效果則差。

（２）一定要充分洗凈甲液后再加乙液，否則背景較臟。

（３）防止水及培養物沾有氯化物。

（４）切忌用接種環涂抹培養物。

（５）載玻片一定要洗凈。先用洗衣粉煮沸，再水洗，干后放在洗液中，浸泡 24 小時，取出水洗除去殘酸，瀝干，存放于９５％ 乙醇中備用。

（６）加熱時置金屬板上，使載玻片受熱均勻。

β－半乳糖苷酶可以催化二糖乳糖水解為單糖：葡萄糖和半乳糖。

β－半乳糖苷酶的活性可以用 X-gal（5-溴－4-氫－3－吲哚－β－D－半乳糖苷）等顯色底物加以檢測，β－半乳糖苷酶可將 X-gal 轉變為不溶性的深藍色沉淀。

X-gal 可以做為組織染色劑，可以在所有表達β－半乳糖苷酶的植物和動物組織上產生顏色。

應該是可以用來病毒感染組織切片染色的。

C

CAE 染色步驟

1、試劑配制：

（1）A 液：萘酚-AS—D 氯醋酸 10 mg 溶于 N,N-二甲基甲酰胺 1 ml 中。

（2）4％ 副品紅液：取鹽酸副品紅 （EM 級）1 g，溶于蒸餾水 20 ml 內，再加入 10m1／L 的 HCl 5m1，稍加溫以增加溶解度，過濾、貯室溫下。于使用前，取等量副品紅液與新鮮的 4％ 亞硝酸鈉混合，之后用淀粉碘化物試紙測試，瞬間試紙應變為藍色才合格，如果不變色，應加入更多的亞硝酸鹽。

（3）B 液：o．1mol/L 的 Michaelis Veronal-醋酸緩沖液 （PH 7.6）30 ml，加入新配制的副品紅液 3 滴，用 1moI／L HCl 使 PH 值調至 6．3。

2、染色步驟：

（1）將 A.、B 二液混合，過濾，加入氟化鈉 （17 mg/10 ml）, 使之*后濃度為 0.04mol/L.

（2）切片置于上述溶液內孵育 1 h（30℃）

（3）流水沖洗。

（4）蘇木素復染。

（5）空氣干燥后封固。

G

Grimelius 硝酸銀反應法（嗜銀反應）:

1、試劑配制：

硝酸銀液: 1% 硝酸銀水溶液 3 毫升 蒸餾水 87 毫升

0.2M 醋酸緩沖液 （PH5.6） 10 毫升

還原液: 對苯二酚 1 克 亞硫酸鈉 5 克 蒸餾水 100 毫升

2、染色步驟:

（1）切片脫蠟至蒸餾水

（2）60℃ 硝酸銀液內 3 小時

（3）用濾紙吸去周圍銀液, 蒸餾水速洗

（4）入 45℃ 的還原液處理 1 分鐘

（5）蒸餾水洗

（6）5% 硫代硫酸鈉處理 1 分鐘 （可不做）

（7）水洗, 脫水, 透明, 封固

3、結果：嗜銀顆粒呈棕黑色。正常時嗜銀顆粒存在于神經內分泌細胞，故此法主要用于神經內分泌腫瘤的診斷。

H

說明HID 染色法

1、染色步驟:

（1）切片脫蠟至蒸餾水

（2）放入預熱的 1 當量鹽酸中 10 分鐘

（3）蒸餾水洗

（4）Schiff 液中染 10 分鐘

（5）自來水洗 15 分鐘至細胞核紅色（如 2～5 步不做，可在染好愛先藍后染核固紅 2 分鐘）

（6）蒸餾水洗

（7）高鐵二胺液 18～24 小時

（8）愛先藍液 （pH2.5） 染 10～20 分鐘

（9）蒸餾水洗

（10）脫水, 透明, 封固

2、結果: 硫酸化酸性粘液呈棕黑色, 羧基化酸性粘液（唾酸粘液）物質藍色。硫酸化酸性粘液可見于大腸粘膜，而小腸粘膜僅出現唾酸粘液，此法多用于確定腸化的分型。

HP（硝酸銀法）

1、試劑配制：

（1）醋酸緩沖貯備液，PH3.6

0.2N 醋酸緩沖液，PH3.6 10 ml

蒸餾水 240 ml

以下各液均用此液配制

（2）1 % 硝酸銀液

硝酸銀 1 g

醋酸緩沖貯備液，PH3.6 100 ml

（3）2 % 硝酸銀液

硝酸銀 0.2 g

醋酸緩沖貯備液，PH3.6 10 ml

（4）5 % 明膠液

明膠 5 g

醋酸緩沖貯備液，PH3.6 100 ml

先把醋酸緩沖貯備液加溫至 40℃ 左右，然后傾入明膠，于 37℃ 溫箱內慢慢溶解，攪拌。

（5）3 % 對苯二酚液

對苯二酚 0.3 g

醋酸緩沖貯備液，PH3.6 10 ml

（6）明膠對苯二酚液

3 % 對苯二酚液 1 ml

5 % 明膠液 15 ml

（7）顯影液

明膠對苯二酚液 16 ml

2 % 硝酸銀液 3 ml

在操作到第 4 步完成前 5 分鐘充分混合，置于 56℃ 水浴箱中保溫待用。

2、操作方法：

（1）組織脫蠟至蒸餾水

（2）醋酸緩沖貯備液洗 2 次

（3）入 1 % 硝酸銀液中，56℃，1 小時

（4）切片不水洗，直接放入預熱的顯影液中 56℃，肉眼呈黃棕色為止。

（5）傾去顯影液，于 56℃ 的水中浸洗 2 分鐘

（6）水洗

（7）脫水，透明，封固。

3、結果：幽門彎曲菌呈棕黑至黑色。

Highman 甲醇剛果紅染色法（類淀粉染色）

1、試劑配制：

甲醇剛果紅染液: 剛果紅 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml

堿性乙醇分化液: 氫氧化鉀 0.2 g 80% 乙醇 100 ml

2、染色步驟:

（1）切片脫蠟至水

（2）甲醇剛果紅染液染 10～20 分鐘

（3）用堿性乙醇分化液分化數秒

（4）水洗

（5）蘇木素復染 2 分鐘

（6）水洗

（7）脫水, 透明, 封固

3、結果：淀粉樣物呈桔紅色。

4、類淀粉染色的應用：

確定淀粉樣變性及玻璃樣變性的膠原組織，后者在剛果紅法染色后呈淡桔色，常用于診斷甲狀腺髓樣癌和胰島細胞瘤等。

L

六胺銀染色法

1、試劑配制：

六胺銀液配制：

3% 六次甲基四胺水溶液 5 ml

2.5% 硝酸銀水溶液 0.5 ml

搖晃，變清，再加 2.5% 四硼酸鈉 1.5~2 ml 加蒸餾水至 30~40 ml

2、步驟：

（1）切片脫蠟至水，蒸餾水洗

（2）0.5% 高碘酸浸 15 分鐘，蒸餾水洗

（3）六胺銀液 60℃，1-2 小時，（或六胺銀液 80-90℃，半小時左右）蒸餾水洗（鏡下基底膜呈黑色）

（4）0.2% 氯化金調色數秒

（5）麗春紅淡染

（6）水速洗

（7）烘干，透明，封片。

3、結果：腎小球基底膜呈黑色，霉菌，彈力纖維及一些網狀纖維也呈黑色。

M

Mallory 三色法

1、步驟

（1）切片脫蠟至水

（2）0.5% 酸性復紅水溶液 1 min

（3）蒸餾水洗

（4）入下液 1-2 min

苯胺藍 0.5 g，桔黃 G 2 g，磷目酸或磷鎢酸 1 g，蒸餾水 100 ml。

（5）蒸餾水洗

（6）95% 乙醇分色

（7）脫水，透明，封片。

2、結果：膠原纖維藍色， 紅細胞桔黃色，核紅色。

Mallory 磷鎢酸～蘇木素染色法（PTAH）

1、試劑配制：

蘇木素 0.1 g 磷鎢酸 2.0 g 蒸餾水 100 ml

先將蘇木素加熱溶于 20 毫升蒸餾水, 再將磷鎢酸溶于 80 毫升蒸餾水。等蘇木素冷卻后，加入磷鎢酸溶液，混合，放置數星期后，才可使用。如急用，可加入 0.2 g 高錳酸鉀, 加速其成熟。

2、染色步驟:

（1）切片脫蠟至蒸餾水。

（2）放入 0.25% 高錳酸鉀水溶液 5 分鐘。

（3）蒸餾水洗。

（4）2.5% 草酸漂白 5 分鐘。

（5）蒸餾水洗多次。

（6）置于磷鎢酸蘇木素溶液 12～24 小時。

（7）95% 酒精快速分化，濾紙吸去剩余酒精，置 60℃ 溫箱中烘干。

（8）二甲苯透明，封固。

3、結果：纖維膠質，肌膠質，神經膠纖維，纖維素，橫紋肌等均染成藍色。膠原，網狀纖維和骨基質著黃色或磚紅色。在工作中常用于觀察橫紋以證實腫瘤細胞是否有橫紋肌分化特征。

Masson 三色染色法

1、試劑配制：

麗春紅酸性品紅液： 麗春紅 0.7 g 酸性品紅 0.3 g

蒸餾水 99 ml 冰醋酸 1 ml

苯胺藍液: 苯胺藍 2 g 蒸餾水 98 ml 醋酸 2 ml

亮綠液： 亮綠 0.2 g 蒸餾水 100 ml 冰醋酸 0.2 ml

苦味酸酒精液: 苦味酸在 95% 酒精中的飽和液 20 ml, 加 95% 酒精 10 ml

2、染色步驟：

（1）切片脫蠟至蒸餾水

（2）蘇木素染 5～10 分鐘

（3）鹽酸酒精分化

（4）流水藍化，蒸餾水洗 （蘇木素可不染）

（5）麗春紅酸性品紅液中染 5～8 分鐘

（6）蒸餾水洗

（7）1% 磷鉬酸中染 1～3 分鐘

（8）不用水洗直接入苯胺藍液或亮綠液 5 分鐘 （如染色效果不佳, 可在冰醋酸內脫色后重染）

（9）水速洗，置 60℃ 溫箱中烘干，二甲苯透明, 封固

3、結果: 膠原纖維藍色（苯胺藍復染）或綠色（亮綠復染）, 肌纖維、纖維素紅色。

4、注意：

（1）此法廣泛用于膠原纖維和平滑肌的鑒別，也為腎組織活檢，觀察腎小球病變的重要染色法，常用于觀察缺血病變的心肌。 用于觀察腎小球病變時，一定要用 2um 以下半薄切片。

（2）細胞核染色后分化很重要，觀察控制著色程度。而 HE 染色則是*常用的一種常規染色方法，但無法區別膠原纖維和肌肉。

N

粘液染色

（一）PAS 染色法

與染糖元的方法相同。

（二）AB（pH2.5） 染色法

1、試劑配制：

愛先藍 8 GX 1 g 蒸餾水 97 ml 冰醋酸 3 ml

核固紅液: 核固紅 0.1 g 硫酸鋁 5 g 麝香草酚 50 mg 蒸餾水 97 ml

2、染色步驟:

（1）切片脫蠟至蒸餾水。

（2）愛先藍液染 10～20 分鐘

（3）蒸餾水洗

（4）核復染 （核固紅 5 分鐘），水洗

（5）脫水, 透明, 封固。

唾液酸及弱硫酸化粘液及一般粘液呈藍色。常用于確定胞漿內空泡的性質，特別是當細胞呈現印戒樣特征時。

J

甲基綠派洛寧法（改良 Cook，1974）

1、試劑配制：

（1）2% 甲基綠水溶液：

甲基綠（methyl green）1 g

蒸餾水加至 50 ml

用三氯甲烷抽提，方法詳后。

（2）5% 派洛寧水溶液：

派洛寧 G（pyronine G）1 g

蒸餾水加至 20 ml

（3）0.2M 醋酸鹽緩沖液（pH 4.8）

0.2M 醋酸液 41 ml

0.2M 醋酸鈉液 59 ml

（4）甲基綠派洛寧染液：

2% 甲基綠水溶液（經抽提）5 ml

5% 派洛寧水溶液 1 ml

蒸餾水 12 ml

0.2M 醋酸鹽緩沖液（pH 4.8）18 ml

甲基綠水溶液的抽提：甲基綠為綠色粉末，屬三苯甲烷染料，這種染料是由氯代甲烷作用于結果晶紫而形成的一種化合物。由于甲基化作用，甲基綠就比甲基綠后，所引進的甲基連接得并不牢固，容易從甲基綠中脫失。另一方面，在甲基化過程中，還有一部分結晶紫并沒有生成甲基綠，因此，也有人認為甲中，常有少量的甲基紫或結晶紫成份。但是，也有人認為甲基紫乃是甲基綠的衰敗產物，甲基綠在儲存過程中，會不斷產生甲基紫。因此，在配制試劑時，必須先將甲基綠所含的甲基紫或結晶紫抽提出來，才能使細胞核內的脫氧核糖核酸染成綠色。抽提方法是取 2% 甲基綠水溶液 20 ml 傾入潔凈分液漏斗，加入三氯甲烷 20 ml 充分搖蕩混合，使其內的甲基紫溶于三氯甲烷中而呈紫紅色。旋動分液漏斗下部的砂塞，慢慢把如此反復更換三氯甲烷，直到三氯甲烷無紫紅色為止，即可得到得純的甲基綠溶液。

2、操作步驟：

（1）新鮮組織固定于 Carnoy 氏液（4℃）3~6 小時，經 95% 酒精和無水酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。

（2）切片經二甲苯脫蠟至蒸餾水。

（3）置入甲基綠派洛寧染液于室溫染 30~60 分鐘。

（4）取出切片，不經水洗，用濾紙吸干多余染液。

（5）用丙酮迅速分化。

（6）轉入丙酮二甲苯（1:1）稍洗。

（7）二甲苯透明 2~3 次。

（8）中性樹膠封固。結果：存在于胞質和核仁內的核糖核酸呈紅紫色，胞核染色質內的脫氧核糖核酸綠色或綠藍色。

3、對照方法：

（1）取另一連續切片用核糖核酸酶（rihonuclease）1 mg/1 ml 于 37℃ 溫箱內消化 3 小時，蒸餾水洗后置入甲基綠派洛寧染液內染色。

（2）切片在 10% 高氯酸（prechloric acid）于 4℃ 處理 12~18 小時，水洗后用 1% 碳酸鈉液中和 2 分鐘，流水沖洗 5 分鐘，再用蒸餾水洗后置入甲基綠派洛寧染液內染色。經上述方法處理后的切片就為陰性。

4、注意事項：

（1）組織不宜用甲醛固定，應選用 Garnoy 氏固定液，因為酒精和醋酸能較好地保存核蛋白。

（2）Garnoy 氏液固定標本的時間不宜太長，超過一天則染色效果不理想。

（3）要注意試劑的質量，特別是派洛寧，常常不同批號的染料，染色的效果不同。甲基綠和派洛寧二者的比例要恰當。

（4）染色液的 pH 應為 4.8 左右，如 pH 過低，甲基綠染色效果差；pH 偏高，則派洛寧染色效果不良。

（5）丙酮分化時間要很好掌握，時間不宜太長。

（6）配妥的甲基綠派洛寧染液用后放冰箱保存，約可使用數周。

染色原理：對此法的染色原理，目前了解得還不夠清楚，一般可從下面兩方面理解。

（a）電離作用：脫氧核糖核酸和核糖核酸都有磷酸基，又有堿基，故為兩性電解質。在一定的條件下，可以電離而帶電荷，因此都有一定的等電點。甲基綠和派洛寧在水中電離后，都產生帶陽電荷的離子。甲基綠電離后，在五價氮處產生二個正電荷，堿性較強。派洛寧電離后僅產生一個正電荷，堿性較甲基綠弱，在染色時二者進行競爭，堿性較強的甲基綠就與胞核（等電點 pH3.8~4.2）進行極性吸著而結合，堿性較弱的派洛寧與胞質（等電點 pH4.6~5.2）吸附結合。

（b）聚合作用：甲基綠對聚合高的 DNA 有親和力，派洛寧對聚合低的 RNA 有親和力。因此，思慮在綠選染 DNA，而派洛寧選染 RNA。應用：PNA 主要存在于胞質及核仁內，它主導細胞的蛋白質合成。在細胞增生，胞質蛋白質合成亢進時，核仁和胞質的 PNA 增加。因此，惡性瘤細胞核仁巨大，胞質嗜堿。漿細胞和免疫母細胞胞質合成免疫球蛋白，胰腺上皮合成胰蛋白酶。因此，這些細胞胞質有很強的嗜堿性。胞質嗜堿，是蛋白質合成增強的標志。

S

脂肪（蘇旦Ⅲ）法

1、試劑配制：

蘇旦Ⅲ 0.1～0.2 70% 酒精 100 ml

將蘇旦Ⅲ置于 70% 酒精中, 加熱飽和, 在未冷前過濾, 靜置一夜。

2、染色步驟：

（1）冰凍切片（8～10 微米）。

（2）70% 酒精固定 1 分鐘。

（3）放入蘇旦Ⅲ酒精溶液中 20～30 分鐘。

（4）70% 酒精洗去多余的染料。

（5）水洗。

（6）蘇木素復染 2～5 分鐘。

（7）1% 鹽酸酒精分化。

（8）水洗，藍化, 甘油封固。

3、結果：脂肪桔黃或紅色。一般用于確定胞漿內空泡究竟是糖原，水變性還是脂滴。

P

高碘酸-六胺銀-馬休黃染色法 （PASM-M）

1、試劑配制：

六胺銀原液： 3 % 六甲基四胺水溶液 （烏洛托品） 20 毫升，5 % 硝酸銀水溶液 10 毫升。

六胺銀工作液：六胺銀原液 30 毫升，雙蒸水 20 毫升，5 % 硼砂 （四硼酸鈉）2 毫升。

核固紅液：核固紅 0.1 克，5 % 硫酸鋁 100 毫升加熱溶解，貯存飽和液待用。

馬休黃液：馬體黃 0.5 克，無水酒精 98 毫升，磷酸 0.2 克。

2、操作方法：

（1）常規脫蠟至水

（2）0.5% 氧化 20 分鐘

（3）蒸餾水洗 3 次

（4）浸入六胺銀工作液中 2 小時左右 （恒溫 58℃）

（5）蒸餾水洗 3 次

（6）0.2% 氯化金 1-2 分鐘

（7）蒸餾水洗 2 次

（8）核固紅染色 10-15 分鐘

（9）馬休黃染色 1 分鐘

（10）放入溫箱烤干，二甲苯透明，中性樹膠封固

3、結果：腎小球毛細血管基膜呈黑色，背景和紅細胞呈黃色，細胞核呈紅色。

4、注意：

（1）六胺銀工作液現配現用，只能用一次。

（2）第 3 步做完后可入 5 % 三氧化鉻 （鉻酸） 水溶液氧化 40 分鐘，再用 1 % 亞硫酸鈉除鉻，背景可能效果更佳。

（3）馬休黃主要是染紅細胞。用無水酒精中脫水，黃色的背景就脫掉，可直接放入溫箱或電吹風吹干，封片。

R

瑞氏－姬姆薩染色方法

1、試劑配制：

原料:

A: 瑞氏染粉 0.8－－1 克；吉姆薩染粉 0.5 克

B: 甘油 33 ml

C：甲醇 500 ml

配法：將 A 放入研缽中，加入少量 B 研磨，再加入少量 B 磨，再加入少量 B 磨……倒出，將未溶部分，繼續加入 B 磨……> 全溶，加入 C，或中間加入 C 亦可。

2、染色步驟：

滴數滴入玻片蓋滿標本，30 秒，再加入雙蒸水或 PBS2-3 倍染 1-3 分中，傾去染液，水洗……封片。

T

Trypan blue（臺盤蘭）排斥實驗：

細胞懸液 0.1 ml 加入 0.4% Trypan blue 生理鹽水溶液 0.1 ml, 混勻后滴在血球記數板上。存活率 = 不著色細胞數/細胞總數 X100%

TTC 方法：

TTC 和活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶反應，生成紅色的甲月贊，用來表示細胞的活力。配制多為 2％，染色要避光，37 度條件下，它是評價腦缺血損傷常用的指標。

V

Van Gieson 法

1、試劑配制：

（1）飽和苦味酸水溶液（約 1.22%）150 ml

（2）1% 酸性品紅 10 ml

（3）上述兩種溶液用前混合在一起。

2、染色步驟：

（1）切片脫蠟至蒸餾水。

（2）蘇木素深染。（10～15 分鐘）

（3）Van Gieson 中染半分鐘。

（4）蒸餾水洗。

（5）置 60℃ 溫箱中烘干。

（6）二甲苯透明，封固。

3、結果：膠原纖維紅色，肌纖維、胞漿、紅細胞黃色。

4、建議：用稀釋的 Van Gieson 液進行染色，不用 95% 的酒精分化，結果色澤鮮艷，而且著色均勻。