綿羊甘露聚糖結合凝集素相關絲氨酸蛋白酶(MASP)ELISA試劑盒

標記：良好的酶結合物取決于兩個條件：即價的和高活性的酶。的活性和純度對制備標記至關重要，因為特反應隨活性和純度的而增強。在酶標記中，的活性有所，故需要純度高、效及抗原親和力強的球蛋白使用親和層析提純的，可性，而且可稀釋使用，非特吸附。

綿羊甘露聚糖結合凝集素相關絲氨酸蛋白酶(MASP)ELISA試劑盒

ELISA：本法主要用于檢測型特。該現已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽（PR）及豬胸膜肺炎（AP）的主要檢測。下面以AP2型的ELISA檢測法為例介紹其操作程序：① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干② 用200μl緩沖液進行封閉 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干③ 加工作量1:4稀釋被檢豬100μl → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干④ 加100μl工作量兔抗AP2型 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干⑤ 加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液⑦ 用ELISA檢測儀測定OD值。本試驗同時設陰、陽性對照、兔抗AP2型陽性對照、空白對照。

試劑盒操作步驟：

   實驗開始，請提配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.加樣：分別設空白孔、孔、待測樣品孔�？瞻卓准訕悠废♂屢�100μl，余孔分別加品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。 為實驗結果有效性，每次實驗請使用新的品溶液。

2.棄去，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記工作液 100μl（取1μl生物素標記加99μl生物素標記稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內配制），37℃,60分鐘。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記工作液） 100μl，37℃，60分鐘。

5.溫育60分鐘后，棄去孔內，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內，此時可見品的3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。

8.用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內進行檢測。

標本的采集及保存：

• ：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

• ：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

• 細胞物上清或其它生物標本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。 (注：標本溶血會影響**檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。)

• 標本的稀釋原則：通過文獻檢索的了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。只有稀釋至曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的中，應做好詳細的記錄。計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。

• 品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為300 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，樣品稀釋液直接作為濃度0 pg/ml，臨用15分鐘內配制。 如配制150 pg/ml品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

• 生物素標記的稀釋原則：臨用以生物素標記稀釋液稀釋，稀釋根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標記加990μl生物素標記稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內配制。

• 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：臨用以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內配置

用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的。顏色的深淺和樣品中呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

實驗結果計算：

    以物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出曲線，根據樣品的OD值由曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用物的濃度與OD值計算出曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

繪制曲線：在Excel工作表中，以品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

注意事項：

1.當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。

2.洗滌非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3.一次加樣時間**控制在5分鐘內，如標本數量多，建議使用排槍加樣。

4.請每次測定的同時做曲線，做復孔。

5.如標本中待測含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請乘以稀釋倍數。

6.在配制品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

7.底物請避光保存。

8.不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

試劑盒性能

1．準確性：品線性回歸與預期濃度相關系數R值，大于等于0.9900。

2．靈敏度檢測濃度小于10 pg/ml。

3．特：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

4．重復性：批內與批見應分別小于9%和15%。

原創作者：上海篤瑪生物科技有限公司