綿羊血管性血友病因子(VWF)ELISA試劑盒靈敏度高，重復性好

ELISA：本法主要用于檢測IgM。由于IgM出現于感染早期，所以檢測出IgM，則可作為某種的早期診斷。ELISA根據所用標記不同可分為標記抗原、標記、標記抗ELISA等幾種，其中以標記抗原ELISA比較有代表性，該的主要程序為：① 用抗u鏈（抗IgM重鏈）包被→37℃ 60分鐘后置4℃過夜，洗滌三次、拋干② 加待檢 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干③ 加酶標抗原 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干④ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值。

試劑盒組成：

注意：使用請檢查試劑盒中試劑的標簽和數量與表格是否一致。

綿羊血管性血友病因子(VWF)ELISA試劑盒靈敏度高，重復性好

操作步驟：1.從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃。2. 設置品孔、樣本孔和空白孔，空白孔什么都不加；品孔各加不同濃度的品 50μL；3. 待測樣本孔先加待測樣本 10μL，再加樣本稀釋液 40μL；4. 隨后品孔和樣本孔中（空白孔不加）加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測 50μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60min。5. 棄去，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置 1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗 板 5 次（也可用洗板機洗板）。6. 所有孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。7. 所有孔加入終止液 50μL，15min 內，在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。

試劑盒操作步驟：

   實驗開始，請提配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.加樣：分別設空白孔、孔、待測樣品孔�？瞻卓准訕悠废♂屢�100μl，余孔分別加品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。 為實驗結果有效性，每次實驗請使用新的品溶液。

2.棄去，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記工作液 100μl（取1μl生物素標記加99μl生物素標記稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內配制），37℃,60分鐘。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記工作液） 100μl，37℃，60分鐘。

5.溫育60分鐘后，棄去孔內，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內，此時可見品的3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。

8.用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內進行檢測。

標本的采集及保存：

• ：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

• ：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

• 細胞物上清或其它生物標本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。 (注：標本溶血會影響**檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。)

• 標本的稀釋原則：通過文獻檢索的了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。只有稀釋至曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的中，應做好詳細的記錄。計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。

• 品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為300 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，樣品稀釋液直接作為濃度0 pg/ml，臨用15分鐘內配制。 如配制150 pg/ml品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

• 生物素標記的稀釋原則：臨用以生物素標記稀釋液稀釋，稀釋根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標記加990μl生物素標記稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內配制。

• 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：臨用以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內配置

競爭ELISA：此法主要用于測定小分子抗原及半抗原，其原理類似于放射測定。其基本程序為：① 包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干② 加入待檢抗原及一定量的酶標抗原（對照孔僅加酶標抗原）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干③ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液④ 用ELISA檢測儀測定OD值。被結合的酶標抗原的量由酶催化底物反應產生有色產物的量來確定，如果待檢溶液中抗原越多，被結合的標記抗原的量就越少，有色產物就，這樣根據有色產物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優點在于快速、特高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測；其主要不足在于每種抗原都要進行酶標記，而且因為抗原的結構不同，還需應用不同的結合。此外，試驗中應用酶標抗原的量較多。

實驗結果計算：

    以物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出曲線，根據樣品的OD值由曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用物的濃度與OD值計算出曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

繪制曲線：在Excel工作表中，以品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

注意事項：

1.當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。

2.洗滌非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3.一次加樣時間**控制在5分鐘內，如標本數量多，建議使用排槍加樣。

4.請每次測定的同時做曲線，做復孔。

5.如標本中待測含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請乘以稀釋倍數。

6.在配制品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

7.底物請避光保存。

8.不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

試劑盒性能

1．準確性：品線性回歸與預期濃度相關系數R值，大于等于0.9900。

2．靈敏度檢測濃度小于10 pg/ml。

3．特：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

4．重復性：批內與批見應分別小于9%和15%。

原創作者：上海篤瑪生物科技有限公司