實驗原理

ELISA實驗原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合,此種結合不會改變抗體的免疫學特性,也不影響酶的生物學活性。

ELISA的發展史:
1√ 目,分子生物學正在并肯定會讓我們對整個生命科學有一個全面而*的認識,其對免疫測定技術發展的影響也是直接而又有效的。

2√ ELISA測定技術的發展主要在于方法學的發展,而方法學的發展依托于試劑生產技術不斷進步更新和型標記物的應用。

3√ ELISA試劑盒它使我們對以一些難以檢測的生物活性物質的測定變得輕而易舉,并且大大提高了檢測的靈敏度和特異性。

新手實驗注意事項:
新手以及那些沒有固定協作供貨商的顧客購買時往往有兩種疑慮,要便是價格,其次,便是質量,國內試劑盒相關于進口試劑盒來說價格自然會低許多。

關于新手的視點來說價格低并不必定就會考慮購買,同時還在猶疑質量問題,由于沒有用過新品牌的試劑盒心中總是在懷疑。

利用交叉實驗即可辨別是否造假:小鼠ELISA檢測試劑盒說明書
1、取出購買的試劑盒A的包被板兩條。
2、一條包被板加試劑盒A的標準品做標準曲線。
3、另一條包被板加試劑盒B的標準品做標準曲線。
4、后續操作按照試劑盒說明書進行,加檢測抗體、酶復合物和底物。

我司在科研域積累了豐富的經驗,正是為了幫助中國的相關單位能夠利用我司的經驗與技術優勢,為中國民眾提供更安全,快捷的生命域。

查找:兔白細胞分化抗原CD109(CD109)ELISA試劑盒

做ELISA標準曲線時需要重點注意的細節問題:
1、設置標準曲線樣品的標準濃度范圍要有一個比較大的跨度,并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度,即樣品的濃度要在標準曲線濃度范圍之內,包括上限和下限;而對于呈S型的標準曲線,盡量要使實驗樣品的濃度在中間坡度陡段,即曲線幾乎成直線的范圍內。
2、檢測標準樣品時,應按濃度遞增順序進行,以減少高濃度對低濃度的影響,提高準確性。
3、標準曲線的樣品數一般為7個點,但至少要保證有5個點。
4、做出的標準曲線相關系數因實驗要求不同而有所變動,但一般來說,相關系數R至少要大于0.98,對于有些實驗,至少要0.99甚至是0.999。
5、樣品的濃度等指標是根據標準曲線計算出來的,所以先要把做標準曲線看作是比做正式實驗還要重要的一件事,否則后面的實驗結果無從談起。
6、好采用倍比稀釋法配制標準曲線中的標準樣品濃度,這樣就能夠保證標準樣品的濃度不會出現較大的偏離。

操作步驟:

1. 包被過程(注意設置空白對照,陰性對照):

將所用抗原用包被稀釋液稀釋到適當濃度(一般所需抗原包被量為每孔20-200μg),每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;棄去孔中液體.(為避免蒸發,板上應加蓋或將板平放在底部有濕紗布的金屬濕盒中)

2. 封閉酶標反應孔:

5%小牛血清置37℃封閉40min.封閉時將封閉液加滿各反應孔,并去除各孔中的氣泡,封閉結束后用洗滌液滿孔洗滌3遍,每遍3min.
洗滌方法:吸干孔內反應液,將洗滌液注滿板孔,放置2min略作搖動,吸干孔內液,傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌次數3次

3. 加入待檢測樣品(建立合適的濃度梯度):

檢測時一般采用1:50-1:400的稀釋度, 應采用較大稀釋體積進行,一般保證樣品吸取量>20μl.
將稀釋好的樣品加入酶標反應孔中,每樣品至少加雙孔, 每孔100μl,置于37℃,40-60min.用洗滌液滿孔洗滌3遍,每遍3min.

4. 加入酶標抗體:

酶標抗體: 根據酶結合物提供商提供的參考工作稀釋度進行. 37℃,30-60min之間.短于30min往往結果不穩定.每孔加100μl.洗滌同。

5. 加入底物液(現用現配):

TMB-過氧化氫尿素溶液,OPD-過氧化氫底物液系統次之.
底物加入量:每孔100μl,置37℃避光放置3-5分鐘,加入終止液顯色.

6. 終止反應:

每孔加入終止液50μl終止反應,于20min內測定實驗結果.

7. 結果判斷:

OPD顯色后采用492nm波長,TMB反應產物檢測需要450nm波長.檢測時一定要行空白孔系統調零.用測定標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均值的比值(P/N)表示,當P/N大于2時作為抗體的效價.(數值的大小依具體檢測要求而定.)

原創作者：上海篤瑪生物科技有限公司