ELISA的樣本實驗準備

在收集樣本都有一個完整的計劃，清楚要檢測的成份是否足夠穩定。對收集后當天就進行檢測的樣本，及時儲存在4℃備用。對于隔天再檢測的樣本，及時分裝后凍存在-20℃備用，有條件的，好-71℃凍存備用。標本

2. 血漿：

應根據標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

3. 尿液：

用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。

4. 細胞培養上清：

檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。

5. 培養細胞

檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

6. 組織標本

切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），或組織蛋白萃取試劑, 用手工或勻漿器將標本勻漿化。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

90分鐘一步法ELISA試劑盒：

1.，靈敏，特異的抗體

2.穩定的重復性和可靠性

3.吸附性能好，空白值低，孔底透明度高和固相載體

4.適用血清，血漿，組織勻漿液，細胞培養上清液，尿液等多種標本型

操作步驟

實驗開始，請提配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔�？瞻卓准訕悠废♂屢�100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。

為實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內配制），37℃,60分鐘。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。

5.溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。

8.用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。

注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。

2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。

3. 為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。

4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、生物素標記抗體工作液或、辣根過氧化物酶標記親和素工作液。

5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以檢測結果的準確性。

洗板方法

手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。

自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

計算

以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

篤瑪代測服務：

技術服務內容： 1、雙抗體夾心法檢測抗原 2、間接法檢測抗體 3、為客戶提供各種ELISA技術進行樣本檢測。

寄標本時需注明以下情況：1、標本編號；2、所測項目；3、是否做復孔；4、聯系方式；5、實驗后標本是否寄回。

代測，有什么具體要求？

樣本要處理過的，寄來的樣本附檢驗要求 （一定要附檢驗要求 ）

樣本寄來要記得保存好，一定要放置冷凍冰袋

什么樣的檢驗要求？要出示什么嗎？

怎樣算是處理過？還是就只是離心保存？

答：離心保存，檢驗要求，就是標本標號，和特殊要求

問：測好多指標 血清不分開可以么？

答：要分開，分好后，分別標上序列號，便于實驗好區分。

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注意事項

1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。

2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3. 一次加樣時間好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標準曲線，好做復孔。

5. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請后乘以稀釋倍數。

6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

7. 底物請避光保存。

8. 不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

⑵ 結合物的定量測定　一般是對結合物中的酶和IgG進行定量測定。常用紫外分光光度計于403nm和280nm進行測定，然后按下列公式計算：

酶量（mg/ml）=OD403×0.42

IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62

對于過碘酸鈉氧化法制備的標記抗體量，按下列公式計算：

IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62

已知酶量和IgG量后，即可計算出標記抗體的摩爾（mol）比值。

HRP/IgG摩爾比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4

結合物中酶總量=HRP（mg/ml）×結合物溶液量

結合物產率=結合物中酶總量/標記時加入的酶量×

用于ELISA的結合物的酶量為400(g/ml時效果一般，為500(g/ml時效果較好，達 1000(g/ml時效果好。mol.比值由于結合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作為主要參數。一般認為mol.比值為0.7時效果一般，1.0時效果較好，1.5-2.0時好。酶結合率為 7%時效果一般，為9%－10%較好，達30%以上時好。

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