1西安交通大學生物醫學分析技術與儀器研究所 2西安天隆科技有限公司 3山東省動物疾病預防與控制中心2009年4月30日

　　摘要：病原檢測方法及儀器是人感染豬流感防控的關鍵環節，針對實時熒光定量PCR分子診斷核酸檢測技術的性以及國產試劑和儀器的成熟性，本文分析了該技術在以往禽流感檢測被采用的國家標準以及使用的廣泛性，*后介紹了*新發布的美國CDC《針對人感染豬流感病毒治療和預防的臨時指南》和我國衛生部《人感染豬流感預防控制技術指南（試行）》，兩部法規都將實時熒光定量PCR確定為人感染豬流感實驗室檢測的確診方法。從以上情況可以獲知：實時熒光定量PCR技術在人感染豬流感診斷中具有、快速、成熟、合法的特點，是一種法定的主流技術，將來實施中，國產化儀器和試劑都有保障。

　　關鍵詞：人感染豬流感  豬流感診斷  快速檢測  實時定量PCR  Real-time RT-PCR

　　全球性的人感染豬流感公共衛生事件發展勢頭迅猛，發生國家眾多，世界衛生組織29日晚已將全球流感大流行警告級別從4級提高到5級，我國也于28日召開了國務院常務會議對防控進行了部署�，F在已進入關鍵的防控措施落實階段，其中檢測與診斷技術至關重要。

　　實時熒光定量PCR技術在以往禽流感診斷中的應用

　　眾所周知，雖雖然本次人感染豬流感事件的病毒基因序列還在進一步確立當中，但本次疫情病原學基礎明確，屬于RNA病毒感染性疾病�；仡櫧陙砀腥綬NA病毒的烈性傳染病，如SARS、禽流感，世界衛生組織及我國衛生行政和技術部門相繼制定了較為成熟的實驗室檢測和診斷標準，其中我國頒布的應用實時熒光定量PCR方法進行實驗室檢測和快速診斷的標準如《GB/T 19438.1—2004禽流感病毒通用熒光RT—PCR檢測方法》、《GB/T 19438.2—2004 H5亞型禽流感病毒熒光RT—PCR檢測方法》、《GB/T 19438.3—2004 H7亞型禽流感病毒熒光RT—PCR檢測方法》等，同時我們也注意到近年來國家針對食品安全尤其是乳品檢測和食物致病菌檢測的實時熒光定量PCR檢測標準，如《SN/T 1632.3-2005 奶粉中阪崎腸桿菌檢驗方法：熒光PCR方法》和《SN/T 1870-2007 食品中致病菌檢測方法：實時PCR法》。以上實時熒光定量PCR技術在禽流感及其它方面檢測的國家標準是該技術在當前的人感染豬流感診斷中應用的基礎和前提。

　　實時熒光定量PCR技術及在我國衛生應急中的應用要求

　　實時熒光定量PCR技術（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction簡稱Real Time PCR，如果用于RNA檢測，這被稱為逆轉錄實時PCR即Real-time RT-PCR）是實時PCR法，它是指對DNA或經過反轉入（RT-PCR）的RNA通過聚合酶鏈式反應并實時監測DNA的放大過程，在擴增的指數增長期就測量擴增產物，因為擴增指數增長期測量值與特異DNA（RNA）起始量存在相關性，從而實現定量檢測。Real Time PCR的基本目標是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監測CT值而實現對原始目標基因的含量定量。目前被普遍使用的多種常規PCR方法如各種凝膠電泳PCR法，終點熒光定量法或PCR-ELISA法叫做終點PCR法。實時熒光定量PCR法的優點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差，實現DNA/RNA的精確定量。普通PCR技術發明于1983年，而實時熒光定量PCR技術發明于上世紀九十年代并于1996年生產出了世界上臺實時熒光定量PCR儀，實時熒光定量PCR技術得以實現的技術要素主要有熒光定量PCR試劑盒和實時熒光定量PCR儀，我國熒光定量PCR試劑盒研發實力強大，生產廠家較多，臨床診斷的品種如HBV/HCV及禽流感診斷試劑盒性能優良、供應充足，基本實現國產化。在豬流感病毒RNA核酸序列明確的情況下，利用現有的試劑研發平臺，人感染豬流感實時熒光定量PCR診斷試劑盒很快就會面世。實時熒光定量PCR儀由于技術含量高，只有少數幾家中國企業有能力生產如西安天隆科技有限公司生產的TL-988系列儀器不但取得了發明、國家科學技術獎、國家重點新產品證書、醫療器械注冊證，而且被國家發改委確立為國家高技術產業化示范工程2008年生物醫學工程專項，產品性能達到水平，在乳品檢測行業市場占有率比進口儀器還高[1-3]。實時熒光定量PCR儀應用廣泛，1999年開始，西方發達國家嘗試將PCR應用于臨床傳染病診斷、食品安全檢測以及血液篩查，目前已相當普及。2008年12月13日中國衛生部下發《衛生應急隊伍裝備參考目錄》（衛辦應急發[2008]207號），其中要求縣級以上衛生應急隊伍建設中必須配備PCR儀和實時熒光定量PCR儀作為傳染病控制類裝備。

　　實時熒光定量PCR技術在豬流感診斷中的作用已有法規確立

　　在人感染豬流感病毒出現以前，針對豬與豬傳染的傳統豬流感疫情，近年來我國科技人員經過不懈努力，探索快速檢測與診斷方法，發表了一系列應用實時熒光定量PCR檢測的研究論文[4-5]。

　　人感染豬流感疫情發生后，美國疾病預防控制中心（CDC）于2009年4月28日發布了針對人感染豬流感病毒治療和預防臨時指南，西安天隆科技有限公司在時間將其翻譯成中文版本[6]。其中規定了確診病例的診斷方法：具有急性發燒呼吸道疾病的臨床癥狀并且經實時熒光定量PCR （real-time RT-PCR）或病毒分離培養 （viral culture）實驗室檢測方法檢驗證實感染A（H1N1）型豬流感病毒。衛生部辦公廳于4月30日印發了《人感染豬流感預防控制技術指南（試行）》的通知》[7]，其中在實驗室檢測和病例診斷報告章節，內容如下：

　　檢測程序

　　呼吸道標本應首先應用real time RT-PCR方法檢測A型流感病毒的M基因、Swine（ H1N1）的HA基因和NP基因，以及質控對照RNP基因。同時，接種MDCK細胞或SPF雞胚進行病毒分離，并測定病毒的全基因組序列。

　　推薦檢測方法

　　用Real-time RT-PCR方法檢測豬流行性感冒（ H1N1病毒）病毒。

　　其他檢測方法

　　快速流感抗原檢測

　　病毒培養

　　免疫熒光法（或裝配的IFA ）

　　顯然，上述衛生部法規中，與“其他檢測方法”不同，實時熒光定量PCR方法被法定為人感染豬流感診斷的推薦檢測方法。