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技術文章
一步PCR介導的降解因子整合方法
點擊次數：5504 發布時間：2016/3/3 9:42:08
用于快速缺失內源性人蛋白的可選擇的一步PCR介導的降解因子整合方法
科羅拉多大學醫學院科學家Ryan M. Sheridan和David L. Bentley開發了一種選擇性的基因盒，它采用CRISPR/Cas9基因編輯器使內源性的人蛋白的C端標記大腸桿菌二氫葉酸還原酶（eDHFR）降解因子。這個基因盒可以利用框內自我剪切2A多肽和嘌呤霉素抗性基因方法進行高效率正確整合。PCR擴增供體的eDHFR基因盒片段，每個片段末端帶有100bp同源片段，它們通過以向導RNA為目標的可以切割3’端開放性閱讀框的雙鏈DNA同源定向修復的方法被整合。據此原理，Ryan M. Sheridan和David L. Bentley生成了含有eDHFR降解因子標簽的三個內源性蛋白的細胞。當從培養基中去除抗生素甲氧芐氨嘧啶時，在2-4小時就缺失了90%以上每個帶有eDHFR標簽的內源性蛋白，這種缺失可以通過再次加入甲氧芐氨嘧啶得到恢復。嘌呤霉素的選擇性可以利用100bp同源性片段高效率回收框內降解因子融合體。該方法可以適用于生成全基因組范圍的突變細胞庫。
科羅拉多大學醫學院科學家Ryan M. Sheridan和David L. Bentley開發了一種選擇性的基因盒，它采用CRISPR/Cas9基因編輯器使內源性的人蛋白的C端標記大腸桿菌二氫葉酸還原酶（eDHFR）降解因子。這個基因盒可以利用框內自我剪切2A多肽和嘌呤霉素抗性基因方法進行高效率正確整合。PCR擴增供體的eDHFR基因盒片段，每個片段末端帶有100bp同源片段，它們通過以向導RNA為目標的可以切割3’端開放性閱讀框的雙鏈DNA同源定向修復的方法被整合。據此原理，Ryan M. Sheridan和David L. Bentley生成了含有eDHFR降解因子標簽的三個內源性蛋白的細胞。當從培養基中去除抗生素甲氧芐氨嘧啶時，在2-4小時就缺失了90%以上每個帶有eDHFR標簽的內源性蛋白，這種缺失可以通過再次加入甲氧芐氨嘧啶得到恢復。嘌呤霉素的選擇性可以利用100bp同源性片段高效率回收框內降解因子融合體。該方法可以適用于生成全基因組范圍的突變細胞庫。
原文：
Ryan M. Sheridan ａnd David L. Bentley, Selectable one-step PCR-mediated integration of a degron for rapid depletion of endogenous human protein, BioTechniques 60:69-74 (February 2016)
原創作者：北京鼎國生物有限責任公司
