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DNA 測序原理

DNA 測序技術主要依據 Sanger 的雙脫氧鏈終止法。以 DNA 單鏈為模板，在特定條件下，用特異的引物在測序級 DNA 聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則，不斷將 4 種脫氧核糖核苷酸 (dNTP) 加到引物的 3''- 羥基末端并使引物鏈得到延伸。這種鏈的延伸是通過引物的 3''- 羥基和脫氧核糖核苷酸底物的 5''- 磷酸基團形成磷酸二酯鍵來完成的。如果這種反應體系中加入雙脫氧核糖核苷酸 (ddNTP) ，這種 2''3''ddNTP 的 5''- 磷酸基團是正常的 (4 種不同的熒光標記 ) ，而 3'' 位置缺少羥基，因此在 DNA 聚合酶作用下，仍然可以通過 5''- 磷酸基團與引物鏈的 3''- 羥基反應摻入到引物鏈中，但是由于 ddNTP 沒有 3''- 羥基，不能繼續與下一個 5''- 磷酸基團形成磷酸二酯鍵而導致引物鏈延伸的終止。這樣，在測序反應體系中， DNA 引物鏈不斷合成與偶然終止，產生一系列的長短不等的核苷酸鏈，然后將這些反應產物進行電泳，即可得測序圖譜。

樣品要求

測序結果常見的幾個問題

1 、 為什么開始一段序列的信號很雜亂，幾乎難以辨別?
這主要是因為殘存的染料單體造成的干擾峰所致，該干擾峰和正常序列峰重疊在一起；另外，測序電泳開始階段電壓有一個穩定期，所以經常有20-50 bp 的緊接著引物的片段讀不清楚，有時甚至更長。

2 、 為什么在序列的末端容易產生 N 值，峰圖較雜?
由于測序反應的信號是逐漸減弱的，所以序列末端的信號會很弱，峰圖自然就會雜亂，加上測序膠的分辨率問題，如果堿基分不開，就會產生 N 值，正常情況下ABI377測序儀能正確讀出500個堿基的有效序列。

3 、 測序結果怎么找不到我的引物序列?
如果找不到測序所用的引物序列。這是正常的，因為引物本身是不被標記的，所以在測序報告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的擴增引物，可能是您克隆的酶切位點距離您的測序引物太近，開始一段序列很雜，幾乎難以辨別，有可能看不清或看不到擴增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此時需找引物的互補序列。

4 、 測序結果怎么看不到我克隆的酶切位點?
可能的原因同上，您克隆的酶切位點距離您的測序引物太近，開始一段序列很雜，幾乎難以辨別，有可能看不清或看不到酶切位點。通常我們會盡量選擇距離酶切位點遠點的引物，當然，若是樣品出現意外原因，如空載、載體自連等，克隆的酶切位點也是看不到的。

5 、 你測出的結果與我預想的不一致，給我的結果與我需要的序列有差距，這是怎么回事?
首先，我們會核實給您的測序結果是否對應您的樣品編號，如果對應的是您的樣品，由于不知您的實驗背景，測得的序列是否與您預想的結果一致我們無法判斷，我們能做到的是檢查發送給您的測序結果和您提供來的樣品是否一致。

6 、 序列圖為什么會有背景噪音(雜帶)?是否會影響測序結果?
序列圖的背景雜帶是由熒光染料引起，如果太強會影響測序結果，要看信噪比，我們給的結果信噪比大都在98%以上。

7 、測序 結果為什么與標準序列有差別？
原因可能有： 樣品個體之間的差別、測序準確率的問題，自動測序儀分析序列的準確并非100%，建議至少測一次雙向，通過雙向測序可以限度減少測序的錯誤。當然盡管我們有時做了努力，但還是保證不了和文獻序列完全一致，但我們測序報告是客戶樣品序列的真實結果。

8 、 PCR 產物測序與克隆后測序序列為什么有差別?
PCR 產物克隆到載體中進行測序，有兩個方面可能序列有變化：首先， PCR 擴增過程中可能產生錯配。將片段克隆到載體中也有可能發生突變；其次，測序的準確率并非100%。

9 、 有雜合位點，但你們的報告上看不到雜合的信號！
如果在您認為應該出現雜合信號的位置上只出現單一的信號，那么可能是您樣品突變的模板與正常的模板的比例沒達到可以測出的濃度。測序反應的信號強度直接與模板的量有關，如果突變的模板所占的比例很低，儀器會自動將它作為背景信號了，很難檢測出來。只有當測序反應體系中正常的和突變的模板量比較接近時，才能較可靠地檢測到突變體的存在。其次，在同一位置，不同堿基的信號強度一般是不一樣的，這樣即使突變的模板所占的比例較高時，也不一定能準確檢測到突變的存在，因為，測序儀是主要用來測序正常的堿基序列的，軟件分析結果時，會盡量提高主峰而將背景信號盡量壓低，以得到盡可能好的結果。尊重結果，我們是不會人為將出現單一的信號修改為雜合位點的。

10 、 DNA 測序樣品用 TE 溶液溶解好不好?
由于 EDTA 是 Taq 聚合酶的一種潛在的抑制物, DNA 的測序反應也是 Taq 酶的聚合反應，需要一個*佳的酶反應條件,因此 DNA 測序樣品溶解時，用滅菌水溶解。

11 、 我送什么形式的菌體樣品好?
菌體的一般形態有、菌液，平板培養菌、穿刺培養菌，甘油保存菌等。我們建議客戶所送的形態以方便且不易受污染為準則，推薦穿刺培養菌。 上�？蛻粲眠^夜培養好的菌液2 ml 。

12 、 為什么你們給我的序列是反的?
測出來的結果與您預期的方向并不一致,可能是片斷插入方向是非定向的，這在 PCR 產物 T/A 克隆中較常見。有時，客戶要求的測序引物離克隆位點較近，如果反向引物相對克隆位點較遠，為得到更好的結果，我們會選擇反向引物測序，若是這種情況，用看圖軟件 Chromas 可以把圖反轉過來，就可得到正向序列。

13 、 Template mixed 為何種情況?
測序結果表現為套峰，測序反應信號很好，測序結果雜亂,即同一個位置有二個峰。
原因可能有：樣品并非單一模板、 PCR 產物中有雜帶、質粒為雙克隆產物、引物特異性不高，有兩個結合點， PCR 產物電泳時看不出，但測序結果能清楚地說明這點。

14 、 polyT 或 polyA 后峰圖雜，怎么也要收費?
這種情況一般表現為 A 、 T 連續結構后面的測序結果出現套峰，是樣品的內在原因。這類問題我們應該同正常測序一樣，給客戶報告，反應按正常收費。

15 、 我的引物做 PCR 條帶很好，但為什么測不出序來？
并不是能做 PCR 反應的引物都能測序，測序所用引物要求較高,必須與模板完全匹配（有時 5'' 端可以有個別堿基的簡并），引物長度一般為20個堿基左右、 GC 含量適中，而且用于測序的引物一定要足夠純。

16 、如果 我的菌種培養得很好，測序應該不會有問題吧?
對于宿主菌，提倡使用宿主菌 DH5 α， DH1 、 和 C600 E.coli 菌株也可， XL1-Blue E.coli 菌株也不錯，但其生長過慢。 JM 系列、 TG1 系列和 HB101 系列 E.coli 菌株等由于產生大量的碳水化合物（即糖），而應當盡量避免使用；其它宿主菌可能會對測序造成影響。

17 、 為什么 G/C rich 的樣品沒結果或結果不好，照常收費?
由于 G/C 連續結構有時會造成反應中途無法正常進行，如果結構在引物下游近處，反應只有一小段的信號，有時甚至反應根本沒信號。對于這種情況，本身就潛在不確定性的測序，有很大的失敗因素。

18 、 PCR 產物150 bp 以下的為什么不適于直接測序?
PCR 產物 150bp 以下的純化和定量都有一定困難，用于測序的 PCR 產物一般不低于150 bp 長度。一個150 bp 的 PCR 產物用于測序，去掉兩個引物的序列大約40到50 bp ， 再加上測序起始端的一些讀不好的堿基，真正能夠得到的有用序列不過幾十堿基。這只是*理想的假設，這么短片斷測序失敗的幾率非常大，因此只能克隆后再進行測序。

19 、 我的質粒樣品很好，測序結果怎不好?
由于原因不明的復雜結構如發卡和回文結構，有時會出現突然信號減弱或消失；有時測序根本不能進行下去， DNA 堿基排列并無特別異常，可能是 DNA 整體出現復雜結構，反應無法進行。

20 、 我的樣品還保留了嗎?我想現在反向再測一個反應。
出于保密原則我們測序樣品只保留一個月，所以若要再測序，請抓緊時間，否則只有重新送樣。

21 、 已經測通了樣品，但重疊的地方有錯配，是為什么?
測通的全序列是拼接后的結果，由于拼接處一般是在一次測序的末端和次個反應開始一段，通常會有一定的雜帶，以序列信號好的為主，次的為參考，但也不絕對。

原創作者：上海閃晶分子生物科技有限公司