摘要建立了不同固定相導致速度差實現堆積的理論模型，并以2一硝基酚，對羥基苯甲酸甲酯和3一硝基酚為模型化合物，進行了堆積現象研究。結果表明，不同固定相導致的速度差能實現堆積，進而顯著提高HPLC的檢測靈敏度。在本文考察的*佳堆積條件下，2一硝基酚，對羥基苯甲酸甲酯和3一硝基酚的檢出限分別降低了4.5，5.0和9.1倍。

　　前言：

　　HPLC是一種廣泛應用的分離分析手段，在環境分析，食品分析，蛋白質組學，藥物代謝和藥物動力學等研究中都有應用。檢測靈敏度一直吸引著眾多研究的關注。峰壓縮可以提供更尖更細的峰，因此可以增加信噪比，靈敏度，改善分離能力。關于HPLC中的峰壓縮現象也有一些報道。同時，在HPLC中也有不同固定相組合的應用，稱二維或多維液相。二維和多維液相中，固定相的組合大多通過閥切換技術實現�？梢詫崿F復雜體系的分離分析。該方法的應用也可以實現復雜混合物體系，簡單樣品前處理方法，進行在線固相萃取等處理，實現體系中化合物的檢測。還有一些報道把相同的色譜柱串聯可以改善分離能力。本文將建立不同固定相導致速度差產生堆積的理論模型，并以3一硝基酚，2一硝基酚，對羥基苯甲酸甲酯為模型化合物，進行堆積現象的考察。

　　1、理論模型：

　　同一化合物在不同的固定相中移動速度不同�；�合物在種固定相中移動的快，在第二種固定相中移動的速度慢，這樣當化合物從移動速度快的固定相進入移動速度隉的固定相中會實現堆積。該堆積現象的示意圖如下圖所示

　圖1不同固定相導致速度差進行堆積前

（a）后（b）示意圖

　　其中，峰壓縮因子可表示為：g=Ckl／k2，

　　其中，當色譜柱體系確定，洗脫條件一定時，C為常數。

　　由以上關系式可見化合物在兩種固定相中的移動速度差別越大，峰壓縮因子越小，峰壓縮越明顯。

　　2、實驗部分

　　2.1 儀器

　　Agilent1100系列：四元泵（帶真空脫氣機），自動進樣器，柱溫箱，AgilentVWD紫外檢測器。色譜柱：苯基柱：4．6×250mm；C18柱：4．6×80mm流速：0．6ml／min，檢測波長：254nm，柱溫25℃。

　　2.2 試劑和藥品

　　色譜純的甲醇、乙腈，均為Fisher公司產品；實驗用水為18．2M三蒸水。3一硝基酚，2一硝基酚，對羥基苯甲酸甲酯均為分析純。

　　2.3 實驗方法

　　1．分別測定化合物在不同固定相中，不同流動相組成時的色譜保留行為

　　2．根據上述實驗結果，確定雙柱體系的固定相類型和組合方式

　　3．選擇不同的速度差考察化合物色譜行為的變化

　　2.4 標準溶液的配制

　　3一硝基酚，2一硝基酚，對羥基苯甲酸甲酯分別用1：1甲醇／水（V／V）配成濃度為1．44，0．095，1．46mg／ml的溶液，使用時逐級稀釋。進樣時的濃度分別為3一硝基酚，2一硝基酚，對羥基苯甲酸甲酯0.0072mg／ml，0．0095mg／mL，0．00292mg／ml。

　　3、結果與討論

　　3.13 一硝基酚，2一硝基酚。對羥基苯甲酸甲酯在苯基柱和ESAC18柱中的色譜保留行為在較寬變化范圍內，考察了流動相組成對化合物保留的影響。分別考察了3一硝基酚、2一硝基酚和對羥基苯甲酸甲酯在在苯基柱和ESAC18柱中的色譜保留行為。各條件下的logk與流動相組成的關系見表1。由表可見，隨著流動相中乙腈百分含量的增加，logk明顯增加，且兩者的增加呈線性相關。在實驗考察范圍內，各條件下的logk與流動相組成的關系均符合容量因子與二元流動相組成之間的關系。

　　表13一硝基酚、對羥基苯甲酸甲酯、

　　2一硝基酚logk與流動相組成的關系

　　3.23 一硝基酚，一硝基酚。對羥基苯甲酸甲酯在苯基柱和ESAC18柱中的移動速度為了確定能產生速度差從而實現堆積的固定相組合，進一步表征了3一硝基酚，2一硝基酚和對羥基苯甲酸甲酯在苯基柱和ESAC18柱中移動速度與流動相組成的關系，結果如圖2所示。由圖2可明顯看出，相同流動相組成條件下，3一硝基酚，2一硝基酚和對羥基苯甲酸甲酯在苯基柱中的移動速度大于在C18中的移動速度。因此可以確定這三個化合物可實現堆積的體系分別為苯基柱一C18柱體系。

　　3.3 速度差對堆積的影響

　　圖3為容量因子表示的速度差與堆積因子的關系。由圖可見，在苯基柱一C18柱體系中，2一硝基酚、對羥基苯甲酸甲酯、3一硝基酚均可實現堆積，且堆積因子與速度差線性相關。速度差越大，即kl／k2值越小，堆積因子越小，堆積得越好。

　　結果表明，2一硝基酚、對羥基苯甲酸甲酯、3一硝基酚在苯基柱一C18柱體系中可以實現堆積，并且洗脫條件一定時，速度差越大堆積程度越好。也就是說，能否實現堆積前提條件是化合物在這兩種固定相中是否存在速度差。同一洗脫條件下，堆積程度的好壞與速度差的大小相關，速度差越大，堆積越明顯。而與化合物的其它性質無關。

圖2 2一硝基酚、對羥基苯甲酸甲酯、3一硝基酚在苯基柱
中的移動速度大于在C1 8柱中的移動速度。

圖32一硝基酚、

對羥基苯甲酸甲酯、3一硝基酚移動速度

　　差（kl／k2）與堆積因子的關系。檢測波長：254nm．流速：

　　0．6ml／min；堆積體系：苯基柱一C18柱體系。

　　圖4 對羥基苯甲酸甲酯堆積前

　�。�1】以及*佳堆積條件下（2）的色譜圖。

　　檢測波長：254nm。流速：0．6mI／min。1：流動相：

　　3％乙腈／97％水。等度洗脫；固定相：苯基柱2：流動相：

　　Omin-38．4min：3％乙腈／97％水：38．4min-38．5min：3％

　　乙腈／97％水-45％乙腈／55％水；38．5min一53min：45％乙

　　腈／55％水。固定相：苯基柱一C18

　　3.4 *佳堆積條件以及*佳堆積條件下的色譜圖

　　選實驗條件下，各模型化合物在相應的柱體系中均可實現堆積。圖4是對羥基苯甲酸甲酯堆積前以及*佳堆積條件下的色譜圖。從圖中可看出與堆積前相比，堆積后保留時間明顯增加，峰高明顯增加，峰寬明顯變窄，實現堆積后靈敏度明顯增加。2一硝基酚和3一硝基酚堆積前后也可觀察到類似現象。

　　3.5 *佳堆積條件下的精密度

　　考察了*佳堆積條件下，各堆積體系保留時間，峰面積，峰高，峰寬，的精密度。結果表明，*佳堆積條件下，各物質在相應的堆積體系中的精密度均小于5％。說明該方法重現性好，穩定性好。

　　3.6 堆積前后檢出限的變化

　　限的高低可以表征檢測靈敏度的高低，檢出限越低，檢測靈敏度越高。分別考察了2一硝基酚、對羥基苯甲酸甲酯、3一硝基酚在堆積前以及在苯基柱一C18柱堆積體系下*佳堆積條件下，各物質相應的檢出限，結果列于表2

　　表2 堆積前和*佳堆積條件下的檢出限（S／N=3，mg/mL）

   4、結論

　　建立了不同固定相導致的速度差實現堆積的理論模型，并進行了驗證和應用。由固定相不同引起的速度差可以導致在線堆積，堆積程度與速度差的大小有關，速度差越大堆積得越好。分別以3一硝基酚，2一硝基酚，對羥基苯基酸甲酯在苯基柱一C18堆積體系的堆積為模型，實驗結果與理論模型一致。該堆積現象可明顯提高檢測靈敏度，在實驗所得的*佳堆積條件下，檢出限降低了4-9倍。該結果表明，對于任何化合物只要選擇合適的柱體系和洗脫條件，都可實現提高檢測靈敏度，降低檢出限的目的。