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蜂蜜中糖的δ13C分析同位素質譜應用報告
點擊次數：377 發布時間：2011/6/9 9:46:09
蜂蜜中糖的δ13C分析同位素質譜應用報告
關鍵詞
前言
糖類是生命中和*常見的分子家族。糖類充當著能量的來源，DNA和RNA的主要組成部分，生物活性化合物的載體和植物組織結構的建筑材料。糖類能夠攜帶其來源和處理加工過程的信息。如果用同位素標記，它可以告訴我們關于其循環途徑和新陳代謝情況。
同位素質譜的應用是建立在對自然界中發生的物理和生化同位素分餾所產生的化合物中同位素間的*小差異的分析基礎之上的。用同位素質譜儀所作的同位素示蹤實驗，只須使用極低量的示蹤物質（<< 0.1 at%）就可給出糖代謝的途徑和代謝率。超高精度同位素質譜甚至能對新陳代謝過程中的天然示蹤物質：如C-3化合物中的C-4化合物進行分析。C-3和C-4是CO2在植物中固定的兩種途徑的首字母縮寫，這兩種固定途徑導致了碳的13C/12C同位素比之差為15‰（δ符號，～0.015at%），高精度同位素質譜的測量精度優于± 0.2 ‰，與其相比，這已經是一個大范圍了。
糖混合物的δ值及重復性的irm-LC/MS測量結果
同位素比監測-液質聯用儀（irm-LC/MS）包括LC IsoLink接口是分析糖類的可選技術。既不需要連接氣相色譜，也不需要連接元素分析器（EA）就可完成。
小樣品量復雜混合物用于做化合物特定同位素分析，無需大量的準備或衍生化工作。對于irm-LC/MS來說不存在由于糖類乙�；a生的同位素轉移。由于不需要衍生化并減少了準備的步驟，用irm-LC/MS分析糖類將得到更準確、更精密和更快速的結果。
一種新的方法是對水溶液中的總體亞微克級樣品的同位素分析。樣品準備的容易度、分析速度（<100秒/樣品）和高靈敏度（EA法的100倍）較傳統EA法優越得多。
irm-LC/MS色譜條件
irm-LC/MS技術
LC IsoLink是種連接高效液相色譜（HPLC）與同位素比質譜的高靈敏度接口，用于重復并精確地聯機測定13C/12C同位素比。在保證色譜分辨率的條件下，可分析所有從HPLC色譜柱上洗脫下來的有機化合物。
在LC IsoLink接口中，樣品在HPLC的洗脫水溶液中被氧化，然后生成的CO2從液相中分離出來。這個過程是定量的和自由分離的過程。
氧化物由兩種溶液組成：氧化劑和催化劑。它們分別由泵抽取并加入到流動相中。在該混合物中所有從HPLC色譜柱上洗脫下來的單有機化合物在通過一個加熱的反應爐時被氧化成一定量的CO2，在一個流動方向向下的分離單元中，CO2從液相中被去除，然后被嵌入He氣流中，He中的單個CO2峰隨即通過一個聯機氣體干燥單元（Nafion™）干燥，然后通過一個打開的狹縫接口進入同位素比質譜。
帶LC IsoLink接口的irm-LC/MS 系統原理圖
摻假蜂蜜的檢測
蜂蜜是一種高品質的天然甜味劑，是由蜜蜂從花蜜或蜜露中生產出來的。植物花蜜主要由葡萄糖和含蔗糖的果糖組成，還含有少量的葡萄糖和果糖的雙糖化合物。這種混合物或者化合物可以用其他來源添加而成以假冒蜂蜜，如高果糖玉米糖漿（四碳糖）。
直到現在，對于用C4糖制作的摻假蜂蜜的檢測是測量蜂蜜的δ13C值和與EA法相比得到的它的蛋白質百分比。但是這種方法對摻假品的可靠的檢測限是四碳糖添加物的碳含量為7%，另一種技術是使用HPLC進行糖的圖像識別。然而多同位素分析很難檢測低量的C-4糖摻假品，尤其添加了C-3糖的摻假品。
有了HPLC和同位素比質譜的結合便可填補這個空白，蜂蜜中每一種單糖的δ13C值都能分析。果糖和葡萄糖的δ13C的比值，其他不常見糖類的檢測，還有各種糖樣本的測定都可以在一個單次HPLC操作中確定。
在不同的兩天時間，分兩批次分析了3號蜂蜜的4份相同樣品，結果證明了irm-LC/MS方法的精密度和可靠度。葡萄糖的平均δ13C值為-24.86 ‰ ± 0.05 ‰，果糖的平均值為-24.86 ‰ ± 0.15 ‰，蔗糖隨其他少量化合物洗脫，不用于精密測定。
表1：8個蜂蜜樣品的irm-LC/MS和EA分析結果
表1所示是用irm-LC/MS和EA分析的8個蜂蜜樣品，以給出天然蜂蜜和摻假蜂蜜的不同情況。EA法可檢測出2個摻假蜂蜜產品，irm-LC/MS法檢測出4個摻假的產品。
峰蜜1的Flu/Glu比值正常，但是由于其很小的負δ值，超過了-23.5 ‰，仍懷疑為摻假產品。蜂蜜主要成分和蛋白質的比較表明有16.7%的摻假率。
蜂蜜1
蜂蜜2顯然為100%的四碳糖。由于蛋白質不能沉淀，所以不能用測蛋白質法。用irm-LC/MS法可以檢測在蔗糖之前的四分的糖，峰面積的Flu/Glu比為0.65，蔗糖和葡萄糖一樣多，果糖的δ13C值比葡萄糖還小2.7‰，這*終證明了此蜂蜜為人工制作。
蜂蜜2
蜂蜜5是摻假產品，但是不能用同位素比的方法檢測出來。盡管如此，Flu/Glu比為4.53還是說明了它是人工蜂蜜。
蜂蜜5
蜂蜜8沒有用EA法檢測是因為0.3‰的差（摻加1.5%四碳糖）在該方法的不確定度之內。葡萄糖和果糖的δ13C差1.3‰清楚地表明該蜂蜜是摻假的。通過比較，Flu/Glu比為2.17還說明添加了含三碳糖的果糖。
用直接循環注射的μ-EA法
LC IsoLink接口使用直接安裝在HPLC色譜柱之后的直接循環注射器，提供了一種快速分析多種樣品的方法。
多樣品的處理方法與HPLC分離化合物的方法一樣。
這種μ-EA法可用于在如下色譜圖中所示的全部可溶性物質的超快多種樣品分析。該方法的優點是直接與某一已知δ13C值的標準樣品比較，一次分析循環時間<100秒。
這種相同的技術也可用在每一次HPLC的運行過程中。在分析多樣品的開始或者結束時，可以注射進某些標準物質而幾乎不損失分析時間。
表2是樣品對已知δ13C值為-29.9‰的苯甲酸分析的結果。EA法（表1）和μ-EA法的分析結果中平均差為0.5‰，這可能是由于所采用的參考間的差異，也可能是因為μ-EA法只分析可溶于水的化合物的原因。
表2 8種蜂蜜樣品的μ-EA法測量結果
μ-EA法：多種蜂蜜樣品直接循環注射分析
原創作者：杭州瑞析科技有限公司
