摘要:植物組織中是否有花色苷及其類型 ,可通過植物組織的顏色、 抽提液的顏色、 抽提液在 pH梯度中的顏色，根據高效液相色譜儀的研究方法等作大致的推斷 ,但對植物組織中的花色苷進行較精確的定性還需做進一步分離、 純化和鑒定.定量分析要依據材料不同而選擇不同的方法 ,本文對花色普定性定量研究方法進行了綜述.
花色苷是一種黃酮類色素 ,存在于大部分的花和果實中 ,一些植物的莖和葉中也存在花色苷.花色苷作
為一種天然食用色素 ,安全、 無毒、 且具有一定的營養和藥理作用 ,在一些功能性食品和化妝品中已有應用,
因此越來越受到人們的重視[ 1, 2 ]
.花色苷是由花色素和糖結合形成的配糖體 ,常見的花色素主要有 6種 ,分
別是天葵色素 （花葵素 ）、 矢車菊素、 飛燕草色素 （翠雀素 ）、 芍藥色素、 牽�；ㄉ睾湾\葵色素 （二甲花翠
素 ）
[ 3 ]
.花色苷的種類決定于花色素的種類、 糖基的種類以及花色素與糖基的結合部位.本文對花色苷定性
定量的方法進行了概述 ,以方便對植物的花色苷進行較為廣泛和深入的研究 ,從而為進一步研究花色苷的性
質奠定基礎.
1　 花色苷的簡單定性
可根據植物體的顏色判斷.當植物組織呈現有藍色或紫色時 ,其肯定含有花色素;呈紅色時,則可能含有
花色素也可能含有類胡蘿卜素 ,這時可根據水溶性來區別 ,花色素類較易溶于水而類胡蘿卜素不易溶于
水[ 2 ]
.若將含有花色素的植物體的切片暴露于醋酸蒸汽中會變成紅色 ,而暴露于氨蒸汽中時 ,會依紫— 藍 —
綠的順序發生顏色變化[ 2 ]
.花色苷的顏色會隨溶液 pH的變化而變化 ,花色苷在強酸性溶液中呈穩定的紅
色 ,弱酸性至中性溶液中呈紅紫色 ,堿性溶液中呈藍色.主要含有天竺葵色素、 矢車菊素的糖苷提取物會呈現
橙到紅色 ,含有甲基花青素糖苷的為深紅 ,含有飛燕草素、 矮牽牛苷配基和錦葵色素糖苷的則會顯出紅色 ,而
糖苷基團的�；赡軙幸环N藍化效果[ 3 ]
.花色苷的�；瘯绊懟ㄉ盏姆�定性.非�；蛦熙；幕�
色苷在 pH值很低時 ,其溶液呈現*強的紅色.隨著 pH值的增大 ,花色苷的顏色將褪至無色 ,*后在高 pH值
時變成紫色或藍色.但是具有兩個或兩個以上�；幕ㄉ赵谡麄� pH值范圍內都表現出相當好的顏色穩
定性[ 4 ]
.將植物組織用石油醚提取 ,若無色則說明提取物不含類胡蘿卜素和葉綠素;向提取物中加入 10%
HCl若呈現各種紅色且加入 25%氨溶液后呈現各種黃綠 （花色苷的藍色與類黃酮的黃色產生 ）則說明含有
花色苷和類黃酮 （除去橙酮 ）
　2　 花色苷的提取
花色苷提取方法的選擇取決于提取的目的和花色苷的種類.多用鹽酸甲醇溶液或蟻酸甲醇液提取[ 7 ]
.
定量提取需在低溫下保持一夜 ,若渾濁還需過濾或離心分離;若只用于層析的樣品 ,則提取 10 - 15 min即
可[ 8 ]
.當提取的花色苷要用于食品著色時 ,考慮到甲醇的毒性 ,應選擇鹽酸乙醇溶液。
提取花色苷時用鹽酸酸化可以保持低 pH值,阻止無�；幕ㄉ盏慕到�,但隨著鹽酸甲醇液或蟻酸甲醇
液的蒸發鹽酸被濃縮其結果會導致花色苷的降解. Revilla等對紅葡萄中色素進行提取的研究表明提取液中鹽
酸的濃度大于 0 . 12 mol /L就會引起含�；幕ㄉ盏牟糠炙鈁 9 ]
.因此為了獲得更接近于天然狀態的花色苷,
可采用中性溶劑或弱有機酸做初步提取.如果既要考慮色素的產量,又要盡量保持色素的原始狀態,可以選擇
有機酸和甲醇提取花色苷,其中,檸檬酸是的,其次是酒石酸、 甲酸、 乙酸和丙酸.一些學者采用丙酮作提取
劑,其效果比酸化的甲醇液要好,且操作可在相對較低的溫度下進行[ 7 ]
.初步提取的花色苷提取物通常很稀,一
般用旋轉蒸發器濃縮.因花色素類不耐高溫,所以濃縮時溫度不要超過 40℃,時間也不宜太久.
3　 花色苷的分離純化
3 . 1　 紙層析
是分離天然色素的一種較為傳統的方法 ,具有快速、 設備簡便等優點 ,但此法分離到的花色苷的量很有
限.常用新華 NO. 3或 What manNO. 3層析紙 ,多以 BAW （正丁醇 -醋酸 -水 = 4∶ 1∶ 2 v/v）、 MAW （正丁醇 -
醋酸 -水 = 4∶ 1∶ 5v/v）為展液.大規模分離 （1 - 100mg）時常用 BH （正丁醇 - 2mol /L鹽酸 = 1∶ 1上層 v/v）和
15%的乙酸為展液.展開后 ,用酸性甲醇或乙醇洗滌 ,乙醚反復沉淀、 濃縮 ,即可得到樣品[ 2, 8 ]
.
3 . 2　 薄層層析
可用硅膠作吸附劑 , Harbon的研究表明以乙酸乙酯 -甲酸 - 2mol /L鹽酸 （ 86∶ 5∶ 9）為展液尤適用于分
離用紙層析很難分離的錦葵色素和芍藥色素[ 8, 10 ]
.也可用纖維素作吸附劑.具有速度快、 分辨力好的優點 ,但
同紙層析法一樣 ,此法分離到的花色苷的量也很有限.
3 . 3　 柱層析
是日前普遍采用的純化花色苷的方法 ,對于不揮發的花色苷的分離是理想的;多以吸附樹脂、 凝膠為吸
附劑.在游離花色素的情況下 ,洗脫速度取決于游離酚羥基對氫鍵的利用程度 ,依次為:錦葵素 >芍藥素 >天
竺葵素 >碧冬茄素 >矢車菊素 >飛燕草素。
3 . 4　HPLC （高效液相色譜 ）
可用制備型 HPLC （p reparative HPLC）來純化花色苷. Fi orini用 Sphefis orb ODS - 2柱對草莓、 接骨木、 茄
子、 蘿卜等的花色苷進行了提取 ,結果表明 HPLC是分離單糖基或�；亩腔腿腔ㄉ盏囊环N有效
的方法[ 11 ]
. 近來 ,科學工作者多用高效快速、 樣品用量極少、 溶劑消耗極少的毛細管電泳 （CE） , 1997年
B ridle用毛細管區帶電泳 （CZE）使得混有草莓和接骨木漿果花色苷獲得了分離. 1998年 Watanabe用膠束電
動毛細管色譜法 （MEKC /MECC）分析了糖果、 果汁、 果凍等食品中的接骨木色素 ,不到 10 min所有的花色苷
都得到分離[ 12 ]
.
4　 花色苷的定性分析
4 . 1　 紙層析與薄層層析
常用的展開劑有 BAW （正丁醇 -乙酸 -水 = 4∶ 1∶ 5v/v/v）、 BH （正丁醇 - 2mol /L鹽酸 = 1∶ 1）、 1%鹽酸
（濃鹽酸 -水 = 3∶ 97）等.可通過各種花色苷在紙層析與薄層層析中的 Rf值來推斷花色苷的種類.各種花色
苷的 Rf值可參考文獻[ 2, 6, 13 ]
等得到.紙層析與薄層層析用于花色苷的定性分析很有限且缺乏精確性.
4 . 2　 紫外 -可見光譜法
通常用 0 . 01%的鹽酸甲醇液作為溶劑測定其紫外吸收值 （也可用 0 . 01%的鹽酸乙醇 ） .花色苷及其色
素元在可見光 465 - 550 nm,紫外光 275 nm處有吸收峰 ,不過通常提取物要在 200 - 700 nm范圍掃描 ,與酰
基化有關[ 3 ]
.在 0 . 01%的鹽酸乙醇測定的λ max要比在 0 . 01%的鹽酸甲醇中的λ max長 10 nm,在 0 . 01%的
鹽酸甲醇中的λ max比在水中的λ max長 15 nm.
用紫外 -可見光譜法測定花色苷其要點如下:
①B環有鄰位羥基的確定 　 將花色苷及其色素元在 200 - 700 nm波長范圍內進行掃描.再加入 AlCl 3 ,
若出現紅移說明 B環有鄰位羥基 ,則可區分矢車菊素、 牽牛色素、 飛燕草素 （有鄰位羥基 ）與天竺葵素、 芍藥
色素、 錦葵色素 （無鄰位羥基 ）。
② 糖基位置的確定 　糖基化會導致可見光區紫移 , 3 - 羥基位的糖基化會導致紫移 （約 10 - 15
nm） , 5 -糖基化會紫移約 7 nm. 3, 5 -糖基化的花色苷與只 3 -羥基位糖基化的同花色素的花色苷不易區
分 ,但 5 -羥基的糖基化與�；瘯� 400 - 570 nm處產生不同的吸收值. 5 -羥基的沒有糖基化 ,只是 3 -
羥基位的糖基化有一個肩峰 , 5 -羥基的糖基化會在這個區域產生一個平臺.糖基位置的確定方法就是
測定 E440 nm /Emax
[ 13 ]
.
③ �；欠翊嬖诘拇_定 　 測定在 300 - 330 nm范圍內有無吸收峰 ,若有則說明有�；�. pH > 0 . 4時 ,復
合�；幕ㄉ赵� 560 - 600 nm或 600 - 640 nm還顯示一個額外的吸收峰[ 3 ]
.
④ 甲基化與羥基化 　 花色苷 3’ 和 5’ 位置的羥基的甲基化會導致微量的紫移 ,但 7 -羥基的甲基化會導
致 8—10 nm的紫移 （伴隨顏色變紅 ）.分子內羥基數目增多會導致紅移 （顏色變紫 ）.
⑤ 其它 　 添加甲醇鈉 （NaOMe）若可見光區的吸收波長紅移 ,且吸光度值不隨時間下降 ,則說明花
色苷 4’ 位有羥基 ,且 3位羥基上形成糖苷[ 10 ]
.若花色苷在紫外光下有熒光則說明 5位有取代基[ 10 ]
.當黃烊
陽離子在 4位上有苯基或甲氧基時 ,通入二氧化硫后不會褪色[ 10 ]
.
4 . 3　HPLC （高效液相色譜 ）
HPLC可用于花色苷的定性和定量測定 ,但由于商業上可提供的花色苷標準物有限 ,所以限制了 HPLC
在花色苷定性方面的應用[ 11 ]
.再加上高效液相色譜儀本身存在的缺點 ,所以通常采用高效液相色譜儀與質
譜、 核磁共振儀等連用的方法.
4 . 4　 花色苷的水解
將花色苷水解后 ,分別測定它的色素元、 糖基和�；俳Y合花色苷測定的結果 ,同樣可推測花色苷的種
類.常用的方法為:在色素的甲醇溶液中按 1∶ 1加入加入 2mol /L鹽酸 ,水浴回流 ,再用戊醇提取色素元 ,以
N -甲基雙辛胺的氯仿溶液除去酸 ,濃縮干燥可得�；瘎悠�;除去色素元和�；瘎┑娜芤阂月确鲁ザ嘤�
的胺 ,濃縮經過微孔過濾器 ,可用于分析。
5　 花色苷的定量測定
5 . 1　 應用朗伯
C為色素的濃度; E為所測得的消光值; V為稀釋倍數;M為標準色素的相對分子量;ε 0為標準色素的分
子消光系數[ 2 ]
.
該方法測定花色苷總量需要在一個恒定的 pH介質中進行.首先要在定性的基礎上確定花色苷的種類,
然后測定單個花色苷的吸收波長下的摩爾消光系數ε或比消光度 E.但單個花色苷的差別很小,而且單
個花色苷組成的比率未知,所以一般用平均比消光度 av E來測定花色苷總量,誤差小于 0 . 2%.單個花色苷
的比消光度 E是很難得到的,可以利用參考文獻提供的數據. Fuleki和 Francis利用該方法對紅莓子中花色
苷總量進行了測定[ 1 ]
.陳炳華、 陳前火等用改進的 Fuleki法測定了果實中花色苷的含量。
5 . 2　 經過加工或儲藏的材料中花色苷總量測定的兩種方法
經過加工或儲藏的材料會產生褐色降解物 ,這些降解物和花色苷具有相同的能量吸收范圍.這類花色苷
總量的測定 ,通常有兩種方法.
5 . 2 . 1　pH示差法
依據花色苷發色團的結構隨 pH而轉換,而超干擾作用的褐色降解物的特性不隨 pH而變化,通過實驗確
定兩個對花色苷吸光度差別,但對花色苷穩定的 pH值,根據 Fuleki的公式可以計算出花色苷總量[ 1 ]
.
5 . 2 . 2　 差減法
先測定樣品在可見光區吸光度 ,經二氧化硫或亞硫酸鹽漂白或過氧化氫氧化后 ,再測定一次吸光
度 ,二者的差值就是花色苷的吸光度.參考用標準花色苷繪制的工作曲線 ,將吸光度換算成濃度.差減法使用
漂白劑因而能降低某些干擾組分的吸光度而使總花色苷濃度偏高。
5 . 3　 單個花色苷的定量分析
對于單個花色苷的定量分析 ,其分離純化是關鍵.早期單個花色苷純化的方法有乙酸鉛法、 聚酰胺法、 聚
乙烯吡咯烷酮法和離子交換樹脂法等 ,其中以離子交換樹脂法*佳. Amberlite CG - 50離子交換樹脂比較常
用.日前 , HPLC方法廣泛地應用于總花色苷和單個花色苷的定量分析.
6　 結束語
近年來 ,隨著人們對人工合成色素毒性及花色苷抗氧化性和生理功能的認識 ,對天然色素的需求量將會
越來越大 ,因此找到一種花色苷含量較多且其穩定性較好的植物、 進一步改進花色苷分離提純的方法使其應
用于生產實踐將是花色苷研究的重要方向.

原創作者：杭州瑞析科技有限公司