高效液相色譜儀色譜填料分析：分離親水氣單胞菌外毒素的功能高分子凝膠色譜填料

曾慶冰 ， 許 家瑞 ， 符若文， 葉巧真
中山大學生命科學院材料科學研究所， 廣東 廣州  5 1 0 2 7 5 
教育部聚合物基復合材料與功能材料重點實驗室
摘要  由丙烯 酰胺 和甲叉丙烯 酰胺 在水 油懸 液中共 聚得 到聚丙烯 酰胺凝膠 Z S P， 并用 I R、 溶
劑吸收 實驗等對合成 的 Z S P的結構進 行了確證 。以商 品葡聚糖凝 膠色譜 S e p h a d   d e x — G1 0 0為對
照 ， 研究 了 ZS P 一 1 0對 中華鱉致 病的親水氣單 胞菌外毒素蛋 白的分 離性能 ， 結果 表明經 S e p h a d e x — 
G1 0 0和 Z S P一 1 0提純的外毒素蛋白均保留了生物活 （ 毒） 性 ， 純度高 。 從 S DS — P AGE分析結果 ， 可以
認為經提純的毒素蛋 白是分 子量 為 3 2 KDa的純品。與 S e p h a d e x — G1 0 0凝膠相 比， 聚丙 烯酰胺凝膠
色譜填料 Z S P一 1 0對 蛋 白質 的回收率更 高， 且成本低廉 ， 不易染菌 ， 是具有 良好 的應 用前景 的蛋 白
質分離色譜填料。 
關鍵詞 ： 親水氣 單胞菌外毒素  聚丙烯酰胺凝膠
1   前言
在生物技術制取蛋 白質 的多級純化過程
中， 液相色譜被指定為一個必須步驟 ， 這表明操
作條件溫和、 又具有分子水平分離能力的液相
色譜為開創現代生物大分子化學樹立了一個里
程碑。在液相色譜 中， 無論是哪一種層析方法 ， 
分離介質 的性能都是分離效果 的首要決定 因
素。目前所使用的多糖類蛋白色譜分離存在的
普遍存在易染菌、 回收率低 、 成本高等問題 。開
發高效的蛋 白分離介質受到國內外學者的廣泛
關注。蛋白分離層析介質 的發展趨勢可以認為
是對以天然大分子為母體 的層析介質不斷地進
行合成工藝改進 ， 提高性能 ， 使老產品更新換
代； 同時大力開發以合成高聚物為骨架 的具有
優異性能的新一代產品。 
親水氣單胞菌在 自然界尤其在水體環境中
分布甚廣， 屬弧菌科， 能引起人和動物的多種疾
病n   ， 特別是水生動物暴發性傳染病 ， 此病在我
國東南各地廣泛流行 ， 尤 以水溫較高的夏秋季
為劇， 導致水生養殖魚類大量死亡， 給漁業生產
造成重大經濟損失 矗   。 
親水氣單胞菌在習慣上被認為是條件致病
菌 ， 隨著細菌本身的研究的深入 ， 這一認識正在
被修正 。已有報道該菌的 O抗原、 菌毛及一些
表 面的非特異性粘附因子與該菌的致病性有
關“   。 然而， 更多的報道指出致病侏能產生細胞
外毒素 ， 而毒素與致病關系密切 ~ 7   。 但是關于
毒素的種類和性質諸說不一 ， 未有定論。 我們用
自制的凝膠色譜介質對 中華鱉致病的親水氣單
胞菌素進行了分離。 
2 實驗部分
2 ． 1 菌種
親水氣單胞菌菌株從廣東省東莞市某養殖
場患病的中華鱉中分離鑒定， 取材選取瀕死新
本研究由國家 自然科學基金委杰 出青年科學基金資助（ 項 目編號 ： 5 9 6 2 5 3 0 7 ） 
2 ． 2 細菌培養
親水氣單胞菌菌株接種合成培養基 中， 搖
床培養 3 5 ℃， 1 0 0   r ／ mi n， 2 4   h。 培養物經 4_ C， 1 O 
0 0 0   r ／ mi n離心 3 0   mi n ， 取上清液。 將此上清液
對小 白鼠（ 體重 1 8 ~2 2   g ） 腹腔進行注射（ 劑量
為 0 ． 4   ml ／ 只） ， 確證其生物活性 。 
2 ． 3   聚丙烯酰胺凝膠色譜填料 Z S P的合成
在 甲 苯 和 三 氯 甲烷 溶 劑 中加 入 少 量
Twe e n 一 8 0和 1   9 ／ 6 聚乙烯醇 ， 滴加丙烯酰胺和甲
又丙烯酰胺水溶液 ， 5 0 V水浴恒溫 ， 滴加完畢待
分散均勻后加入適量過硫酸銨， 待反應完成后 ， 
撤去水浴 ， 體系 自然冷卻至室溫， 減壓抽濾 ， 真
空干燥 ， 篩選出 2 0 0 ~3 0 0目產物備用。 
2 ． 4   紅外分析： 采用布魯克 EQUI NOX   5 5傅
里葉變換紅外光譜儀 ， 波數范 圍為 4 0 0 ~4   0 0 0 
c m～， 樣品采用 KB r壓片法進行測試。 
2 ． 5 溶劑吸收實驗
將干燥至恒重 的 0 ． 1 ～0 ． 2   g   Z S P聚合物
凝膠置于一特制的底部帶有多孔玻璃砂板的試
管中， 在室溫下置于溶劑 （ 水） 中浸泡 2 4   h。試
管用橡膠蓋密封 ， 放到一離心管內， 用 2   0 0 0 ~4 
0 0 0   r ／ mi n離心 1 5   mi n除去過量的溶劑 ， 將帶
有溶脹劑的樹脂的試管迅速轉移到密閉的燒瓶
中稱重。溶劑吸收量用 1   g干樹脂 吸收的溶劑
重 量來表 示 。 
2 ． 6 毒素的提純
2 ． 6 ． 1 硫酸銨鹽析
用 Na OH調節細菌培養物上清液至 p H   6 ， 
再加入硫酸銨至 7 O   的飽和度 ， 4 ℃靜置 4   h， 
1 0   0 0 0   r ／ mi n， 4 ℃離心 3 0   mi n， 去上清液， 沉淀
溶于洗脫緩沖液 中， 對相同緩沖液透析過夜 ， 將
透析后的樣品用 P EG2 0   0 0 0進行濃縮 ， 即為粗
提毒素。 
2 ． 6 ． 2  S e p h a d e x   G一 1 O 0凝膠過濾
將粗提 毒素 于 4 ℃裝 S e p h a d e x   G1 0 0柱
（ P h a ma c i a產品， 1 ． 6×5 0   c m， 平均液及洗脫液
均為 5 0   mmo l ／ L   Tr i s — HC1 ， p H  7 ． 8 ） ， 流速為 1 2 
ml ／ h， 每管收集 4   ml ， 用紫外檢測儀 2 8 0   n m進
行檢測， 合并生物活性部分 ， 凍干濃縮。 
2 ． 6 ． 3  Z S P 一 1 0凝膠過濾
將 粗 提 毒 素 于 4 n C裝 交 聯 度 為 1 O   9 ／ 5 的
Z S P 一 1 0 柱 （ 自制 ， 1 ． 6 ×5 0   c m， 平衡液及洗脫液
均 為 0 ． 2   mo l ／ I  Na Ac — HAc ， p H5 ． O ） ， 流速為
1 2   ml ／· h， 每管收集 4   ml ， 用紫外檢測以 2 8 0 
n m進行檢測 ， 合并生物活性部分， 凍干濃縮 。 
2 ． 7   SDS— PAGE
采 用 La e mml i 不 連續 S DS — P AGE系統 ， 
按常規方法在小型蛋白電泳儀上進行 1 0 0   V恒
壓電泳約 3   h。 所用分離膠濃度為 1 2   9 ／ 6 ， 濃縮膠
濃度為 4   9 ／ 6 ， 用考馬斯蘭法染色。 
2 ． 8 小 白鼠毒性試驗
小 白鼠體重 1 8 ～2 2   g， 每組 2只， 分別腹腔
注射 0 ． 4   ml 毒素樣品。 
3 結果與討論
3 ． 1  I R分析
圖 1   聚丙烯酰胺凝膠填料的 I R譜圖
圖 1是 聚 丙烯 酰胺 凝 膠 滲 透色 譜填 料  而引起的。 3 1 8 8   c m 處的強峰是 N— H伸縮振動
Z S P 一 1 0的紅外譜圖。3 3 9 4 c m 處寬而強的峰是  吸收峰。 2 9 3 2   c m  和 2 7 8 1   c m  處的強峰是 CH
一
OH伸縮振動的譜帶 ， 由樣 品中殘留水分存在  基團中不對稱和對 稱 C— H伸縮振動峰。1 6 6 3 
—
1 9 —  
CHI NES E   J ． DI Al   ． & ARTI F． ORGANS   Vo 1 ． 1 4   No ． 1   Ma r c h， 2 0 0 3 
c m。 處的強峰是 C=0伸縮振動吸收峰。1 4 0 0 
c m～， 1 3 0 0 c m～， l l 0 0 c m 和 1 0 0 0 c m。附 近的峰
是 C— N伸縮振動和一 NH變形振動引起的。6 2 7 
c m  處的峰是 N— H面外變形吸收峰。 
3 ． 2  Z S P樹脂的吸水率
圖 2是 Z S P樹脂吸水率一交聯度曲線。 很
明顯， 在交聯度為 5   ～2 0   的范圍內樹脂 的
吸水率與交聯度成正 比。 由此可推測， 在所合成
的聚合物中交聯點的分布是 比較均勻的。 
O0   5 ．o o％   I o． 00 ％   l 5 ． O0 ％  2 0． o（   2   5 |t ） 儡 
空娃度
圖 2  Z S P樹脂吸水率一 交聯度 曲線
3 ． 3 毒素的純化
粗提毒素經 S e p h a d e x- -Gl O 0凝膠色譜柱
純化后 回收率為 1 8 ． 8 3   ， 經交聯度為 1 0   的
聚 丙 烯 酰 胺 Z S P 一 1 0柱 純 化 后 回 收 率 為
6 8 ． 0 5   ， 洗脫液蛋峰分別為圖 3和圖 4 。上樣
后 S e p h a d e x a —G1 0 0濕凝膠 在 4 ℃只能保 存
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圖 3 毒素的 S e p h a d e x — G   1 0 0層析
3 ． 4   SDS— PAGE
經 S e p h a d e x—G  1 0 0和聚丙 烯酰胺 Z S P一 
1 0柱純化后的毒素進行 S DS — P AGE， 考馬斯蘭
圖 5   S e p h a d e x純化 S DS — P AGE 
行 M： 分子量標準 ， 行 A： 
粗提毒素 ． 行 B： 提純毒素
1 0天左右即會滋生霉菌， 不能再重復使用。而
Z S P 一 1 0 在 同樣的條件下可保存半年。 提純毒素
經濃縮后注射小 白鼠， 2 4   h后小 白鼠死 亡， 可
以認為兩種凝膠色譜柱均保留了外毒素蛋白質
的生物 活性 。 
圖 6  ZS P 一 1 0純化 S DS — PAGE
行 M： 分子量標準， 行 A； 
粗提毒素 ， 行 B ： 提純毒素
4   結論  1
由丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺在水油懸液中
共 聚得 到交 聯度 為 1 0   的 聚丙 烯 酰胺 凝膠  ‘ 
Z S P 一 1 0 。Z S P 一 1 0對使 中華鱉致病 的親水氣單
胞菌外毒素蛋 白的分離性能 良好 ， 保留了生物  ． 
活（ 毒） 性， 純度 高。 從 S D S — P AG E分析結果 ， 可
以認為經提純 的毒素蛋白是分子量為 3 2   KDa   5 
的純品。與 S e p h a d e x — G1 0 0凝膠相比， 聚丙烯
酰胺凝膠色填料 Z S P一 1 0對蛋 白質 的回收率更  6 
高， 且成本低廉 ， 不易染菌 ， 是具有 良好的應用
前景的蛋白質分離色譜填料。   7 
參考文獻
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4 3 8 
（ 收稿 ： 2 0 0 0 — 1 0 — 1 8 ） 
群體反應性抗體（ P RA） 高的免疫吸附治療
于  穎 ， 孟 建中
濟南 軍區總醫院血液凈化 中心 ， 山東  濟南 2 5 0 0 3 1 
摘 要  目的 ： 研究高群體反應性抗體 （ P RA） 的患者進行 腎移植， 術后常發生超急性 （ HAR） 
或急性排斥 （ AR） 反應 ， 導致移植腎功能 喪失 。方 法； 1 8例 PRA高的患者行免疫吸附 （ 1 A） 治療
前血液透析 1 ～6年。8例第 2次腎移植 ， 3例第 3次腎移植 。P RA  2例>7 O   ， 5例 >5 O   ， 5例
>3 O   ， 6例>2 O   。 采 用 日本 p l a s a u t o — l Q免疫吸附系統機進行 免疫 吸附治療 。 結果 ； 1 8例 P RA
高 的患者行 l A 治療 3 ～8次后 ， 復查 PRA． 9例為 0 ， 6例<5   ， 3例 <1 O   ， 都 達到了治療效果 。 
結論 ： P RA 的檢測對提 高腎移植 成功率和存活率具有實際意義 ． 移 植后未發生 HAR和 AR， 為
患者解決 了因 PRA 高而不能 腎移植 的難題 。 
關鍵詞 ： 群體反應性抗體 免疫吸附治療  腎移植
腎移植是治療慢性腎功能不全終末期腎衰
的主要方法， 若移植后的腎功能恢復正常， 
其發揮的作用遠大于任何類型的透析。腎移植
的優勢還在于能使患者骨髓代謝恢復正常 ， 消
除貧血， 并能正常生活與工作。 而群體反應性抗
體（ P RA） 高的患者進行 腎移植， 術后常發生超
急性 （ HAR） 或急排 斥 （ AR） 反應， 導致移植 腎
功能喪失 ， 甚至危機患者生命 。為解決這一難
題， 我院 自2 0 0 1年 1月至今， 為 1 8例患者行免
疫吸附（ I A） 治療療效顯著 ， 現總結如下 。 
1 資料與方法
1 ． 1 一般資料
我院 自2 0 0 1年 1月至今為 1 8例 PRA高
的患者行免疫吸附（ I A） 治療 ， 男性 1 1例， 女性
7例 ， 年齡 1 8 ～6 5歲。 9例原發病均為慢性腎小
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