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中文名： 瓊脂糖凝膠4B
英文名：Sepharose 4B
供應商：上海遠慕
規格：100ml/500ml
顆粒大�。�45-165um
適用范圍：科研，實驗
瓊脂糖凝膠4B說明：
1. 瓊脂糖凝膠4B是一種層析介質，sapharose 4B用4%瓊脂糖凝膠制用于篩層析用作制備親層析介質基本骨架。
2.瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網狀結構，網狀結構的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結構是穩定的，可以在許多條件下使用（如水，pH4-9范圍內的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學滅菌活處理。
瓊脂糖凝膠4B分離方法：
1. 分離時流速不可太快，切切不可心急，所謂欲速則不達；接餾分時可開全速，節省時間。
2.柱子盡可能長，葡聚糖凝膠柱長的增加將極大地改善分離，所不要吝惜填料，寧可將填料全裝在一根大柱子中，不要將填料裝成幾根小柱。所謂集中優勢兵力，打擊敵人。
3.餾分一定要接的細，可1/10，或1/20 個保留體積接成一餾分。
4.鞣質成分死吸附嚴重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣質。
5.葡聚糖凝膠對黃酮類成分的分離效果極佳，方法很成型，有大量文獻參考。
6.填料反復使用，每次用完，一般可用甲醇將柱子洗干凈，然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來，待用。暫時不用試可以水洗→含水醇洗（醇的濃度逐步遞增）→醇洗，*后泡在醇中貯于磨口瓶中備用。如長期不用時，可在以上處理基礎上，減壓抽干，再用少量乙迷洗凈抽干，室溫充分揮散至無醚味后，60～80°C干燥后保存。
瓊脂糖凝膠4B操作流程：
1.乙醇浸泡：在室溫下，將干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小時，并不斷攪拌以保證凝膠溶脹，用無鹽水洗去殘存的乙醇濾干;
2.無鹽水浸泡：室溫下，在無鹽水中充分溶脹24小時，間隙攪拌，以保證凝膠的完全溶脹，然后；
3.鹽酸浸泡：在常溫下再用0.2NHCl浸泡12小時，間隙攪拌，濾干，水洗只中性；
4.將溶脹好的凝膠脫氣后（真空抽濾或超聲波）根據裝柱要求一次性置入柱內，注意保持濕態裝柱，并避免柱內產生氣泡或斷層；
5.上樣前平衡層析柱至少3-5個柱體積直到記錄儀基線變得平穩為止（流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值）；
6.凝膠過濾的上樣量一般為5%的柱床體積，我們建議初次上樣控制在1-2%的床體積，視分離情況可以調整；脫鹽時上樣量可以達到20%的柱床體積，柱高的選擇也與分離要求相關，柱高控制在40-50cm以下，過高的凝膠層會引起較大的反壓，應當盡可能避免。難分離物質要有一定柱高和流速控制，脫鹽時高徑比為5：1即可；
7.洗脫方法：可以用無鹽水，也可以采用上柱時的緩沖液洗脫；在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脫或鹽梯度洗脫也可以完全分離純化；
8.在位清洗（CIP）凝膠使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床內沉淀的及頑固殘留的蛋白。方法是以40cm/h用1M氫氧化鈉反向洗四個柱體積，再以至少三個柱體積平衡緩沖液再生。
1.乙醇浸泡：在室溫下，將干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小時，并不斷攪拌以保證凝膠溶脹，用無鹽水洗去殘存的乙醇濾干;
2.無鹽水浸泡：室溫下，在無鹽水中充分溶脹24小時，間隙攪拌，以保證凝膠的完全溶脹，然后；
3.鹽酸浸泡：在常溫下再用0.2NHCl浸泡12小時，間隙攪拌，濾干，水洗只中性；
4.將溶脹好的凝膠脫氣后（真空抽濾或超聲波）根據裝柱要求一次性置入柱內，注意保持濕態裝柱，并避免柱內產生氣泡或斷層；
5.上樣前平衡層析柱至少3-5個柱體積直到記錄儀基線變得平穩為止（流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值）；
6.凝膠過濾的上樣量一般為5%的柱床體積，我們建議初次上樣控制在1-2%的床體積，視分離情況可以調整；脫鹽時上樣量可以達到20%的柱床體積，柱高的選擇也與分離要求相關，柱高控制在40-50cm以下，過高的凝膠層會引起較大的反壓，應當盡可能避免。難分離物質要有一定柱高和流速控制，脫鹽時高徑比為5：1即可；
7.洗脫方法：可以用無鹽水，也可以采用上柱時的緩沖液洗脫；在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脫或鹽梯度洗脫也可以完全分離純化；
8.在位清洗（CIP）凝膠使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床內沉淀的及頑固殘留的蛋白。方法是以40cm/h用1M氫氧化鈉反向洗四個柱體積，再以至少三個柱體積平衡緩沖液再生。
瓊脂糖凝膠4B注意事項：
1.該凝膠從冷室或冰箱中取出后在室溫下緩慢振搖恢復到室溫，然后再裝柱，以免產生氣泡影響柱效。
2.吸附：10-30Tris-HCl緩沖液，pH7.5，其中含有0.2MNaCl，2mMMnCl2，2mMCaCl2。平衡10個柱子床體積。
3.洗脫：可以用pH4.5-6的緩沖液洗脫，也可以用100-500mM糖類競爭線性或階段洗脫，例如用甲基葡萄糖等甲基吡喃糖，其中緩沖液可以是10-30Tris-HCl緩沖液，pH7.5，含有0.2MNaCl.洗脫*多可以到10個柱床體積。
4.上樣樣品必須與平衡柱子的緩沖液pH、電導相同。
5.ConA瓊脂糖凝膠FF親和填料的再生處理方法：先用0.1MTris-HClpH8.5緩沖液洗含0.2MNaCl洗10個柱床體積，然后用20mM醋酸緩沖液，pH4.5洗3個床體積,*后用20%乙醇洗3個床體積即可。
6.對于吸附力強的物質可以用0.1M硼酸鹽緩沖液，pH6.5低流速洗3-5個柱床體積。也可以用乙醇線性洗脫20-50%。
7.該親和填料保存條件為20%乙醇，+4~8℃。
瓊脂糖凝膠4B配制流程：
a,稱量、b,熔膠、c,倒膠、d,拔梳。
1.稱量 我們通常所說的0.8%、1%的膠都是指的質量體積分數，即所稱取的瓊脂糖粉的質量（g）比所加的TBE緩沖液的體積（mL）即膠的濃度。緩沖液的體積根據膠板的大小而定。如小膠板0.8%的膠需要瓊脂粉0.104g，TBE13mL。
2.熔膠 將所稱量的瓊脂粉與TBE在錐形瓶中混合，在微波爐內反復加熱2~3次至瓊脂粉溶解并無氣泡。
3.倒膠 干凈的膠槽內擺好梳子，往膠內滴加1uL左右核酸染料，混勻，待冷卻至不燙手，輕輕倒入膠板內。
4.拔梳.待大約20min后，輕輕拔掉梳子（若不好拔，可以滴加適量的TBE緩沖液）。
標簽： 瓊脂糖凝膠4B分離方法
