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單細胞測序前的3大關鍵問題，您都處理對了嗎？
在無數實戰經驗中，制備高質量的單細胞懸液被公認為重中之重。實驗過程中，如單細胞活性不高，細胞數過低，以及污染和雜質等問題，都會影響到有效單細胞數的產出、單細胞核酸的質量等，*終得到的單細胞數據分析及統計結果不可信。
那么，組織如何解離？需要選什么酶？還需要注意什么？科技君根據相關權威文獻整理了單細胞懸液制備的方法和小貼士，讓我們一起來解決單細胞研究方案中的攔路虎。
實體組織解離關鍵——酶的合理選擇
實體組織解離兩大步驟，包含機械分離和酶消化處理。
首先，組織需要通過物理切割或刀片切碎，然后通過酶消化來分離細胞。特定的組織消化酶及消化時間不同，相關建議可參考如下表格：人和小鼠的部分組織類型——肝臟、肺、皮膚、脾臟、消化道、胰腺、腎臟、視網膜等[1]。
表1 人鼠各類型組織酶解單細胞懸液方法總結[1]
除此之外，常用酶的類型還包括：Accutase™、彈性蛋白酶和膠原酶，以及商業酶混合物，如 TrypLE Express 和 Liberase Blendzyme 等[1]，當然也可以選擇美天旎品牌的各類組織解離試劑盒。
另外，科技君也總結已發表文獻中常見實體組織解離所采用的酶，供大家參考，步驟詳見參考文獻：
小鼠心臟肌肉組織：Collagenase IV ａnd Dispase II[2]
上皮組織：dispase(Corning) -商業化試劑[3]
小鼠胚胎組織：TrypLE Express[4]
乳腺癌及其癌旁組織: Liberase TL (Sigma) -商業化試劑[5]
小鼠主動脈血管：Collagenase type II (C6885, Sigma Aldrich) 和 Elastase (LS002292, Worthington Biochemistry)[6]
小鼠腦垂體：Collagenase type II, trypsin， DNase I，amphotericin B 混合[7]
血液處理成關鍵——離心穩定操作[1]
樣品經過密度離心(例如使用Ficoll-Paque或Histopaque-1077技術)，可以直接用于外周血單核細胞（PBMC）捕獲[1]。
建議不少于5mL EDTA 抗凝血，且不要使用肝素抗凝管收集血液；同時注意在合適轉數離心操作后，管中內容物分為三層，上層為血漿（內含細胞碎片），中間層為分層液，底層為紅細胞，在上、中層液體界面處可見到乳白色混濁的單核細胞層（ 白膜層，�。�。此時，需使用無菌吸管小心沿離心管壁周緣吸取界面層單核細胞后，再加入HBSS /PBS重懸。更多注意事項請參見華大科技單細胞送樣建議。
單細胞懸液制備的8條建議[1]
1. 建議采用無菌樣品處理方式，包括使用不含核酸酶的試劑和耗材。
2. 為降低對細胞的損傷，移液和離心應保持在程度。在一定的離心速度、時間和溫度下，細胞濃度和大小直接影響制備的效率。
3. 在進行細胞清洗和重懸過程中，使用具有合適大小的器皿，避免高濃度導致細胞集聚和結塊，請注意選擇。
4. 應使用適當大小的細胞過濾器過濾懸浮液，孔徑大于細胞直徑，以去除團塊和碎片。
5. 細胞清洗和復蘇，推薦使用含牛血清的磷酸鹽緩沖鹽水(不含鈣和鎂)，減少細胞損失和聚集的白蛋白。
6. 細胞裂解升高可導致細胞團塊形成，在細胞分離過程中，DNase I可減少細胞團塊形成。
7. 細胞團塊會導致自動細胞計數器低估單個細胞的有效濃度，因此制備后應盡快處理懸浮液，在30分鐘內處理。
8. 總之，在單細胞制備中，盡可能減少細胞聚集物、死亡細胞、非細胞核酸和逆轉錄(RT)抑制劑是非常重要的。為了在限度地提高不同細胞類型的純度和無偏回收率的同時，*小化這些污染物，可能需要應用優化，例如，調整洗滌步驟的數量、洗滌溶液的組成、離心條件和/或過濾器類型。
