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干貨：原代腦微血管內皮細胞（BMEC）分離步驟
點擊次數：350 發布時間：2019/5/5
近一直在逛 dxy 的論壇，看看好多寶寶關于原代提取中都有疑問，這個是我們實驗員在做原代腦微血管內皮細胞（BMEC）時，我這邊做的一個實驗記錄及分離步驟，僅僅供大家參考。
一、實驗材料：
SD 大鼠（4～6 周齡，雄性），大號手術剪，鑷子，50 ml 離心管，6 孔板，75% 乙醇，生理鹽水，膠原酶，25%BSA，多聚賴氨酸，DMEM/F12 基礎培養基，DMEM/F12 完全培養基
二、實驗儀器：
超凈工作臺，低速離心機，二氧化碳培養箱
三、實驗步驟：
1. 將大鼠對大鼠實行 anlesi，浸泡在 75% 乙醇中約 1 min
2. 剪開頭部皮膚，快速取出大腦，盡量保證完整性
3. 將大腦放入預冷的 DMEM/F12 基礎培養基中
4. 在超凈工作臺中，去掉外層血痂，腦膜，外層血管（平皿上操作）
5. 去掉白質（松散狀），保留灰質（貝殼狀的左右腦）
6. 4 ℃ 預冷培養基多次清洗
7. 將大腦剪成 1 mm3 的塊狀，轉移至無菌的 50 ml 離心管中，將塊狀大腦剪碎，移液槍吹打
8. 900 rpm 室溫離心 4 min，棄去上清，然后添加 5 ml DMEM/F12 無血清培養基
- 用移液槍吹打均勻，然后補加 10 ml 培養基，加 100 μL 膠原酶Ⅱ，37 ℃ 消化 30～45 min，同時用 1 ml 多聚賴氨酸包被 6 孔板。
- 消化完成后加入培養基中和，900rpm 室溫離心 10 min。
- 直接加入 15 ml 25%BAS，2000rpm 室溫離心 20 min。離心后離心管出現分層，下層深紅色（少量）為腦微血管細胞。
- 生理鹽水輕輕沖洗 6 孔板中多余的多聚賴氨酸，沖洗 2 次。
- 取下層腦微血管沉淀，加入生理鹽水混勻，900rpm 室溫離心 5 min。用新鮮 DMEM/F12 完全培養基將細胞重懸，重懸后轉移至 6 孔板中培養。
