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化學交聯質譜法研究蛋白質動態新途徑
近日，我所董夢秋實驗室與武漢物理與數學研究所唐淳實驗室合作者成功探索了利用化學交聯質譜（chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry, or CXMS）和結構計算來研究蛋白質動態的新途徑，并發布了通用流程。
到目前為止，結構生物學研究主要關注蛋白質的基態結構，但是蛋白質行使功能往往需要在基態和激發態之間轉變構象。解析蛋白質的激發態構象和動態結構對于X射線晶體學和電鏡等傳統結構生物學方法是一大難題。核磁共振（NMR）雖然適合研究蛋白質在溶液中的多種構象，但是僅限于 50 kDa 以下的蛋白，而且需要大量的高度純化的蛋白。
董夢秋實驗室一直從事化學交聯質譜技術 CXMS 的開發和應用（Yang B, Nature Methods 2012; Lu S, Nature Methods 2015; Tan D, eLife 2016）。蛋白樣品中兩個氨基酸之間發生交聯反應，必須滿足交聯劑的化學特異性要求（如氨基特異性）以及空間距離小于或等于交聯劑臂長的要求。因此，由 CXMS 獲得的交聯位點對提供了可用于結構計算的距離約束信息。作為結構生物學的新工具，特別是單分子電鏡技術的輔助工具，CXMS 在很多大型蛋白質復合體的結構解析中做出了貢獻。但是，這個技術還存在一些問題，其中*令人困擾的是：即便用*嚴苛的篩選標準，總有小部分交聯位點對在晶體結構（一般是基態構象）中的距離大于交聯劑臂長（"over-length" chemical cross-links）。對于此類數據，大部分實驗室選擇丟棄或者放松距離約束（如果結構未知）。本文兩個實驗室一年前合作發現，分子間的高可信度過長交聯反映了蛋白 - 蛋白間的弱（或瞬時）相互作用（Gong Z, Biophysics Reports 2015）。本文重點研究了蛋白內不同結構域之間的相對運動。實驗結果表明，分子內的高可信度過長交聯來源于蛋白質的激發態構象；它們不是制造麻煩的問題數據，而是 “眾里尋他千百度” 的反映蛋白質動態的珍貴信息。
作者通過交聯數據和結構計算發現，結合了鈣離子但沒有結合配體肽段或蛋白的鈣調蛋白（Ca2+-CaM） 除了采取啞鈴狀的開放態構象（基態），還有一種閉合態構象，非常接近之前用 NMR 手段觀察到的激發態構象。這種閉合態構象與結合了各種配體的 Ca2+-CaM 的晶體結構或 NMR 結構也非常相似，說明配體肽段或蛋白的結合穩定了原已存在的 Ca2+-CaM 的閉合態構象。本文還用同樣方法研究了細菌磷酸轉移系統中的蛋白 EIN 和谷氨酰胺結合蛋白 QBP，發現它們均含有基態構象之外的一種激發態構象。
本文建立了一套基于交聯數據的結構模擬計算方法，內容包括：用 15N 同位素標記的蛋白與相對應的天然同位素標記的蛋白等量混合后進行交聯質譜分析，從中得到高可信度的分子內交聯數據，然后采用專門開發的 DynaXL 軟件進行構象模擬計算。DynaXL 包含結構域識別、模擬交聯反應、分子動力學模擬等多個模塊。它首先嘗試用基態構象模擬交聯反應，如果不能滿足全部交聯約束，則添加一個構象，直到所有交聯約束都得以滿足。同類其它算法只考慮單一構象，試圖讓單個構象滿足所有交聯數據；當蛋白質在溶液中存在多種構象時，容易造成過擬合，得到錯誤結構。
已發表的 NMR 研究表明，Ca2+-CaM 的激發態構象在溶液中所占的比例小于 5%；EIN 和 QBP 的激發態構象很可能由于豐度過低未能被 NMR 檢測到。這說明 CXMS-DynaXL 方法可以靈敏地檢測到溶液中的低豐度構象，靈敏度達到甚至超過 NMR，且不受蛋白大小限制，可以廣泛應用于蛋白質動態變化研究。
