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不用酶切，PCR 也可以幫你完成分子克隆
點擊次數：537 發布時間：2019/2/18
限制性內切酶脾氣很大，遇到「不開心的事兒」她就會罷工。同樣地，當限制性內切酶遇到了甲基化的質粒，她也就這樣悄無聲息地罷工了，留下實驗失敗的你獨自流淚。
甲基化是細菌用來保護自己的基因序列不被自身合成的限制性內切酶所切割，是細菌的一種自我保護機制。常見的甲基化包括了 Dam+、Dcm+、EcoKI+、EcoBI+ 以及真核細胞中的 CpG 等。同理，不同的甲基化也能夠識別特定的序列，從而在特定的堿基上進行。如果當限制性內切酶所識別的序列與甲基化識別的序列相同或者重疊時，限制性內切酶將不能夠切開該位點序列（見表二）。另外，還需注意一點，我們實驗所采用的大腸桿菌是否是屬于上述甲基化的陽性菌株，如果是，恭喜你，實驗失敗很正常，懵逼樹下的懵逼果等你去嘗嘗。所以，快去看看你所用的限制性內切酶是否和甲基化的識別序列重合，你的克隆菌株是否是甲基化的陽性菌株吧。
不用酶切，PCR 也可以幫你完成分子克�。�
1、反式 PCR
我們都知道，在做分子克隆的時候，必須要用限制性內切酶將環狀質粒切割成為線性，才能夠連接我們的目的片段。那么，大家有沒有想過，在我們的酶切位點兩頭，以質粒為模板設計引物，反向直接擴增我們的質粒呢？這樣的質粒天生就是線性化的質粒，而且無需進行搖菌培養質粒提取和酶切等復雜的操作。這就是我們所說的反式 PCR。是不是很簡單？對，就是這么簡單到你懷疑人生。但有一個問題來了，整個反應體系中的模板即我們原來的環狀質粒，如果在進行克隆連接的時候豈不是也被導入到宿主細胞中表達，也就是說我們挑菌的時候也是有概率會挑到這些空載載體的！如何解決？接著看就明白了。
2、DpnI 切割反式 PCR 中的環狀質粒
之前小編在甲基化中提到過，我們還有一個特殊的限制性內切酶沒有提到，它就是 DpnI。這個酶之所以特殊，其原因在于它不同于其他的限制性內切酶，它只有當存在 GATC 序列被甲基化的時候才能夠發揮它的活性，進行完全的切割，也就是說它和其他受到甲基化影響的酶是相反的。甲基化只有在甲基化陽性的原核或者真核生物中才能夠存在。所以，當我們用 Dam+菌株提取的質粒進行反式 PCR 的時候，為了降低后期克隆實驗的空載率，我們需要使用 DpnI 來消化我們原來用于模板擴增的環狀質粒，由于質粒上存在多個 GATC 甲基化的序列，因此，DpnI 能夠將原來環狀質粒直接切割成多條片段，另外，PCR 擴增的線性質粒并沒有在原核生物體內進行過甲基化，因此線性質粒的序列不會被 DpnI 識別切割，從而達到我們分離環狀質粒和線性質粒的需求。這里需要提醒下小伙伴們，如果你們的質粒模板是從 Dam-菌株里面提取的，那么以上的方法就不再適用了！至于原因，大家可以想一想，小編就不在這里贅述了。
關于限制性內切酶，目前已經商業化的品種已經兩百多種，作為目前世界排名靠前的內切酶生產商，莫納生物對這類基礎工具酶已經研究探索多年，為了打破國外四十多年的壟斷地位，繞過保護，莫納生物自主研發了全新的內切酶生產工藝，目前在售的快速內切酶已經四十多種（持續增長中），現階段已經基本滿足常規的生物學實驗需求。
都 9102 年了，你還在用傳統的方法做克��？
克隆虐我千百遍，我待克隆如初戀。做個克隆，至少需要兩天的時間，還要忙前忙后準備一大堆需要的東西。麻不麻煩，累不累��！有這個時間，我多看兩篇文獻，多編兩行 Python 代碼不好嗎？小編說過，越基礎的實驗越是需要牢固掌握，但同樣越是基礎的實驗越是需要我們節省時間，提高效率。
甲基化是細菌用來保護自己的基因序列不被自身合成的限制性內切酶所切割，是細菌的一種自我保護機制。常見的甲基化包括了 Dam+、Dcm+、EcoKI+、EcoBI+ 以及真核細胞中的 CpG 等。同理，不同的甲基化也能夠識別特定的序列，從而在特定的堿基上進行。如果當限制性內切酶所識別的序列與甲基化識別的序列相同或者重疊時，限制性內切酶將不能夠切開該位點序列（見表二）。另外，還需注意一點，我們實驗所采用的大腸桿菌是否是屬于上述甲基化的陽性菌株，如果是，恭喜你，實驗失敗很正常，懵逼樹下的懵逼果等你去嘗嘗。所以，快去看看你所用的限制性內切酶是否和甲基化的識別序列重合，你的克隆菌株是否是甲基化的陽性菌株吧。
不用酶切，PCR 也可以幫你完成分子克�。�
1、反式 PCR
我們都知道，在做分子克隆的時候，必須要用限制性內切酶將環狀質粒切割成為線性，才能夠連接我們的目的片段。那么，大家有沒有想過，在我們的酶切位點兩頭，以質粒為模板設計引物，反向直接擴增我們的質粒呢？這樣的質粒天生就是線性化的質粒，而且無需進行搖菌培養質粒提取和酶切等復雜的操作。這就是我們所說的反式 PCR。是不是很簡單？對，就是這么簡單到你懷疑人生。但有一個問題來了，整個反應體系中的模板即我們原來的環狀質粒，如果在進行克隆連接的時候豈不是也被導入到宿主細胞中表達，也就是說我們挑菌的時候也是有概率會挑到這些空載載體的！如何解決？接著看就明白了。
2、DpnI 切割反式 PCR 中的環狀質粒
之前小編在甲基化中提到過，我們還有一個特殊的限制性內切酶沒有提到，它就是 DpnI。這個酶之所以特殊，其原因在于它不同于其他的限制性內切酶，它只有當存在 GATC 序列被甲基化的時候才能夠發揮它的活性，進行完全的切割，也就是說它和其他受到甲基化影響的酶是相反的。甲基化只有在甲基化陽性的原核或者真核生物中才能夠存在。所以，當我們用 Dam+菌株提取的質粒進行反式 PCR 的時候，為了降低后期克隆實驗的空載率，我們需要使用 DpnI 來消化我們原來用于模板擴增的環狀質粒，由于質粒上存在多個 GATC 甲基化的序列，因此，DpnI 能夠將原來環狀質粒直接切割成多條片段，另外，PCR 擴增的線性質粒并沒有在原核生物體內進行過甲基化，因此線性質粒的序列不會被 DpnI 識別切割，從而達到我們分離環狀質粒和線性質粒的需求。這里需要提醒下小伙伴們，如果你們的質粒模板是從 Dam-菌株里面提取的，那么以上的方法就不再適用了！至于原因，大家可以想一想，小編就不在這里贅述了。
關于限制性內切酶，目前已經商業化的品種已經兩百多種，作為目前世界排名靠前的內切酶生產商，莫納生物對這類基礎工具酶已經研究探索多年，為了打破國外四十多年的壟斷地位，繞過保護，莫納生物自主研發了全新的內切酶生產工藝，目前在售的快速內切酶已經四十多種（持續增長中），現階段已經基本滿足常規的生物學實驗需求。
都 9102 年了，你還在用傳統的方法做克��？
克隆虐我千百遍，我待克隆如初戀。做個克隆，至少需要兩天的時間，還要忙前忙后準備一大堆需要的東西。麻不麻煩，累不累��！有這個時間，我多看兩篇文獻，多編兩行 Python 代碼不好嗎？小編說過，越基礎的實驗越是需要牢固掌握，但同樣越是基礎的實驗越是需要我們節省時間，提高效率。
