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細胞凋亡WB沒成功，你是不是用了RIPA？
點擊次數：907 發布時間：2018/8/29
細胞凋亡是一種在基因控制下的細胞主動死亡過程，通常表現為核濃縮，起皺，膜發泡以及 DNA 片段化。WB 是研究細胞凋亡機理的基本方法，但是 WB 也不是誰都能做成功的，因為有可能你的步就做錯了！用 WB 做細胞凋亡研究樣品制備是步，樣品制備方法至關重要否則會得到錯誤的結果和結論。
樣品制備，看你是不是這樣做的：
自配裂解液或者購買 RIPA，加上樣品研磨啊研磨，孵育啊孵育，然后離心扔掉沉淀（RIPA 不可溶組分），取上清（RIPA 可溶組分）進行下游實驗。
對對對！都是這么做啊，扔了取上清！
且慢，我們扔掉了，扔掉了，扔掉了一些啥？要不要緊，影響細胞凋亡的實驗結果不？
例一． Zapata et al., （1998）. Granzyme Release ａnd Caspase Activation in Activated Human T-Lymphocytes. J Biol Chem 1998, 273:6916-6920.
Caspase 家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中 caspase-3 為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的 Caspase-3 由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，*終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase 的活性明顯下降。
研究方法：
1.分別使用 RIPA 和 2%SDS + 超聲提取未激活 T 淋巴細胞（Lanes 1 和 5）和激活的 T 淋巴細胞（Lanes 2-4 和 6-8）裂解細胞提取總蛋白
2.WB 進行 caspase-3, caspase-7, parp ａnd GD1 檢測
主要發現：
p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中，但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中卻不存在。證明了 RIPA buffer 提取蛋白時會人工激活 caspase-3 ａnd caspase-7。用 Laemmli 緩沖液加超聲處理可進一步從 RIPA 不可溶性組分中提取出蛋白。
樣品制備，看你是不是這樣做的：
自配裂解液或者購買 RIPA，加上樣品研磨啊研磨，孵育啊孵育，然后離心扔掉沉淀（RIPA 不可溶組分），取上清（RIPA 可溶組分）進行下游實驗。
對對對！都是這么做啊，扔了取上清！
且慢，我們扔掉了，扔掉了，扔掉了一些啥？要不要緊，影響細胞凋亡的實驗結果不？
例一． Zapata et al., （1998）. Granzyme Release ａnd Caspase Activation in Activated Human T-Lymphocytes. J Biol Chem 1998, 273:6916-6920.
Caspase 家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中 caspase-3 為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的 Caspase-3 由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，*終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase 的活性明顯下降。
研究方法：
1.分別使用 RIPA 和 2%SDS + 超聲提取未激活 T 淋巴細胞（Lanes 1 和 5）和激活的 T 淋巴細胞（Lanes 2-4 和 6-8）裂解細胞提取總蛋白
2.WB 進行 caspase-3, caspase-7, parp ａnd GD1 檢測
主要發現：
p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中，但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中卻不存在。證明了 RIPA buffer 提取蛋白時會人工激活 caspase-3 ａnd caspase-7。用 Laemmli 緩沖液加超聲處理可進一步從 RIPA 不可溶性組分中提取出蛋白。
