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酪氨酸酶抗體的檢測方法
點擊次數：849 發布時間：2018/8/2 17:22:55
酪氨酸酶（TYR）是一種75kD含銅酶，來源于胚胎神經鞘細胞，是黑色素代謝和兒茶酚胺的關鍵酶。Spritz等人證實TYR是一種銅結合蛋白，有銅A和銅B位點。離子銅特異性能與人TYR結合，一個位點的銅結合可以促進另一個位點的銅結合。組氨酸在銅B位點協調其結合。TYR的多肽鏈的適當折疊對銅結合及其催化活性是關鍵性的，TYR突變可中斷銅結合使其催化活性喪失。眼、皮膚白化病是由于TYR基因突變所致，該病TYR陽性患者色素性皮膚損害發生率高。超氧化物負離子（O2-）能穿透黑素細胞（MC）入胞內，TYR通過利用O2-保護MC，免受O2-細胞毒作用。在黑素瘤患者黑素瘤細胞（MMC）和MC中抗氧化系統失衡，內源性反應性氧生成，細胞內不能抵御內源性超氧化物的攻擊.白癜風患者血清中TYR抗體的生成，提示白癜風的發病與自身免疫有關。
檢測方法
TYR抗體在白癜風患者血清中檢出。Song等1994年用細菌合成人TYR，免疫印跡法檢測TYR抗體。這種方法相對不敏感且不能定量檢測。Baharav等1996年使用蘑菇TYR，ELISA法檢測TYR抗體，此法敏感，但所用蘑菇TYR與人TYR同源性低。而Xie等1996年則用人MC提取物作為TYR的來源，免疫沉淀法等檢測TYR抗體。Kemp等1997年采用放免法（RIA）檢測TYR抗體。近來此法已被用來檢測自身免疫性疾病患者血清中的特異性抗體。這種方法能敏感定量檢測抗體。
特性
1.抗TYR抗體的產生：用人TYR cDNA轉染L細胞，獲得L-TY細胞，免疫同源性C3H鼠，即用5×106L-TY細胞與等量Frend佐劑混合，腹膜內注入有6周鼠齡的雌性C3H鼠體內，每次間隔2周，第3，4次用5×106細胞裂解物與等量Frend佐劑混合免疫動物。第4次注射后3天，抽血，分離血清，同時用未轉染L細胞去除非特異反應性成分，結果用人TYR cDNA轉染L細胞免疫的8只C3H鼠中，4次免疫后，有4只對TYR cDNA轉染L細胞的鼠血清抗體滴度>10-4，C3H鼠免疫前及正常鼠對L-TY細胞無反應性。用L-TY細胞免疫動物獲得的血清能沉淀L-TY和有色素MMC細胞裂解物。免疫沉淀法可見分子量為70kD～80kD的寬幅條帶，可能為TYR生物合成中間代謝產物，未轉染L細胞，TYR陰性無色素MMC中未見特異性條帶。
2.免疫印跡法檢測TYR抗體：用抗TYR血清10-3稀釋度，在TYR轉染L細胞和有色素MMC可見細胞內顆粒染色，親代L細胞內無胞內染色，在L-TY細胞，細胞內染色顆粒位于核周和胞質內。無色素MMC，不表達TYR mRNA，無TYR活性，與TYR抗體無相互作用。有色素MMC和培養MC，高度表達TYR活性，黑素形成多，細胞質顆粒深度染色。
3.單克隆抗體.AT99能識別TRP-1糖蛋白，AT99能與人有色素MMC表達的TRP-1和轉染L-GP細（用編碼TRP-1全長cDNA轉染鼠L細胞獲得）表達的全長人TRP-1cDNA相互作用，且免疫耗竭實驗證實AT99不耗竭能產生分子量為70kD～80kD條帶的抗TYR血清，免疫熒光分析抗TYR抗體與TRP-1，TYR l-GP細胞無相互作用，抗TYR抗體不沉淀來自L-GP細胞的TRP-1。
3.TYR抗體使TYR活性喪失：免疫鼠血清能沉淀鼠MMC，L-TY細胞裂解物，提示免疫鼠血清能滅活有色素MMC及L-TY細胞TYR的活性，加入L-多巴底物后，見黑素形成，提示TYR活性恢復，免疫沉淀時如用免疫前血清則無黑素形成。
原創作者：上海遠慕生物科技有限公司
