丙酮酸羧化酶（PC）試劑盒（分光光度法 ）
貨號：BC0730
規格：50 管/48 樣
產品內容：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體47 mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：液體×1 支，4℃保存；
試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存；
試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；
產品說明：
丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1）廣泛存在于動物、霉菌和酵母的線粒體中，
催化丙酮酸、ATP、CO2 和水生成草酰乙酸、ADP 和Pi，是糖異生過程的個限速酶，在保證
血糖的動態平衡方面起著重要的作用。
PC催化丙酮酸、ATP、CO2 和水生成草酰乙酸、ADP 和Pi，蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙
酸和NADH 生成蘋果酸和NAD+，在340nm下測定NADH 氧化速率，即可反映PC 活性。
需自備的儀器和用品：
分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、 樣本的前處理
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、 稱取約0.1g 組織或收集500 萬細菌或細胞，加入1mL 提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿600g，4℃離心5min。
3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的PC（此步可選做）。
5、 在步驟④的沉淀中加入1mL 提取液，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10
秒，重復30 次），用于線粒體PC 活性測定。
二、測定步驟
1、 分光光度計預熱30min 以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。
2、 工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三轉移到試劑一中混合溶解待用；置于37℃（哺乳動物）
或25℃（其它物種）預熱5 分鐘；用不完的試劑4℃保存一周；
試劑四的配制：在試劑四瓶中加入2.5mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存一周；
3、 在1mL 石英比色皿中加入50μL 樣本、50μL 試劑四和900μL 工作液，立即混勻，記錄340nm 處
初始吸光值A1 和 2min 后的吸光值A2，計算A=A1-A2。
注意：在該試劑盒中，若ΔA 大于0.5，需將樣本用提取液稀釋適當倍數后測定，使ΔA 小于0.5 可
提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應稀釋倍數。
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PC 活性計算：
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
PC（U/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10
9]÷（V 樣×Cpr） ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算
單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
PC（U/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10
9]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T=1608×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算：
單位定義：每1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
PC（U/10
4 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10
9]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=3.215×ΔA
V 反總：反應體系總體積，1×10
-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×10
3 L / mol /cm；d：比色皿
光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，2 min；
Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。